암세포에서 anoikis의 결정 기전

Abstract

[한글]

Anoikis는 세포가 주위 환경과 적절한 접촉을 하지 못하는 경우에 일어나는 세포 사멸 과정의 한 형태로서 anoikis의 기전에 대한 이해는 악성 종양이 일단 전이를 시작하면 anoikis에 저항성을 획득하기 때문에 암 연구에서 특히 중요한 의미를 가진다. 따라서 본 연구에서는 anoikis의 유발을 결정하는 기전을 확인해보고자 하였다. 실험 결과 실험에 사용한 식도 상피 세포 암 세포주는 anoikis 양성 및 음성 세포 군으로 분류할 수 있었으며, 두 그룹간에 세포의 adhesion과 관련된 물질의 차이를 확인하기 위하여 cDNA microarray를 실행한 결과 integrin β1, integrin β4, caveolin-1 및 E-cadherin 유전자가 anoikis 양성 세포주들에서 높은 수준으로 발현됨을 확인하였고, 단백질 수준에서도 동일한 양상을 나타냄을 확인하였다. 세포의 adhesion과 관련되어 성장, 분화 및 생존에 관여하는 신호 전달 경로 중 Erk의 활성을 확인해 본 결과 세포가 matrix로부터 떨어져 배양된 시간이 경과함에 따라서 anoikis 양성 세포에서는 그 활성이 감소하였으나, 음성 세포에서는 그 활성이 48시간 까지 유지되는 것을 관찰하였다. Erk 활성의 억제제를 전처치하였을 때 anoikis 음성 세포가 양성으로 표현형이 변환되리라는 가정과는 반대로 음성 세포의 세포 사멸에는 아무런 영향을 미치지 못하였고 오히려 양성 세포에서 세포 사멸의 과정이 억제되는 것을 관찰하였다. 이 결과는 최근의 연구결과와 일치되는 결과이며25-29 Erk의 활성이 세포 사멸의 진행에 있어 필요한 신호 전달 경로임을 확인해주었다. Integrin β1에 결합하여 PKB/Akt의 활성을 조절할 수 있는 것으로 알려진 ILK의 활성을 측정한 결과 integrin β1을 발현하지 않는 anoikis 음성인 세포에서 ILK의 활성이 48시간 경과 후에도 여전히 높게 유지되는 것을 확인하였으며, 또한 ILK에 의해 조절되는 PKB/Akt의 serine 473의 인산화도 음성 세포에서 높게 유지되는 것을 확인할 수 있었다. PI(3)K와 결합하여 그 활성을 조절하면서 세포의 adhesion과 관련된 물질로서 Rho family에 속하는 Rac1과 cdc42의 활성 변화를 확인한 결과 세포가 matrix로부터 떨어졌을 경우 Rac1/cdc42의 활성이 anoikis 양성세포에서 감소하는 것을 확인하였으며, 이와 동반하여 PKB/Akt의 활성도 감소되는 것을 확인하였다. 또한 세포-세포간 결합의 중요한 매개 물질이면서 anoikis에 대해 저항성을 나타내는데 중요한 영향을 미치는 것으로 알려져 있는30-32,36 E-cadherin의 경우 anoikis 양성인 세포에서는 그 발현을 관찰할 수 있었으나 음성 세포에서는 E-cadherin을 확인할 수 없었으며, 대신 N-cadherin이 발현됨을 확인하였다. 이상의 연구 결과를 종합하면 암세포의 anoikis를 결정하는 중요 기전은 PI(3)K/PKB/Akt의 신호 전달 경로와 Raf/MEK/Erk 경로간의 cross talk을 통한 생존 신호 또는 사멸 신호의 조절이라고 생각되어진다.

[영문]Anoikis is defined as apoptosis induced by inappropriate cell-matrix interactions. In the present study, we used several esophageal cancer cell lines as a model system to elucidate the molecular mechanism of anoikis. To test whether the cancer cell lines are anoikis sensitive or resistant, we cultured the cell lines on the poly-HEMA coated tissue culture plate for 3, 24 and 48 hours. Based on the phase contrast microscopic observation, all the cell lines formed compact multicellular aggregates (MCA) by 16 hours post-plating. Lysates were prepared at each time points from each cell line, and western blot immunostaining was performed with antibodies against PARP and pro-caspase 3. Contrary to previous reports, E-cadherin expressing TE2 and TE3 were apoptotic (anoikis sensitive) even though they formed E-cadherin mediated MCA but N-cadherin expressing, instead of E-cadherin, HCE4 and HCE7 were not apoptotic (anoikis resistant). As it has been known that PI(3)K/Akt signaling pathway is involved in cell survival, we checked the activity of Akt using phospho-Akt (ser 473) antibody and found that anoikis sensitive cells have relatively low Akt activity. We also checked Erk activity and found that anoikis resistant cells showed higher activity of Erk than that of anoikis sensitive cells and the activity was maintained until 48 hrs of suspension. Contrary to our expectation, anoikis sensitive cells were protected from killing in the presence of Erk specific inhibitor, U0126, suggesting that anoikis might need certain degree of activity of Erk. Taken together, our data showed that E-cadherin mediated cell-cell adhesion could not protect the cells from apoptosis triggered by loss of cell-matrix adhesion and certain degree of Erk activity might be needed in inducing anoikis.