Down-regulation of 1α,25-dihydroxyvitaminD3-induced osteoclastogenesis in response to xylitol in mouse

Abstract

[한글]

자일리톨은 식물에 존재하는 5탄당의 당알콜으로 항 우식 효과 등 여러 가지 다양한 기능을 가지고 있다. 이전의 연구에서 자일리톨이 골 흡수를 감소시키고 골 강도를 증가 시킨다는 논문들이 발표 되었으나 분자 생물학적인 기전은 아직 보고된 바가 없었다.

본 연구는 활성형 비타민 D3나 sRANKL을 공존 배양계와 RAW 264.7에 투여하여 파골세포 분화를 유도한 후에 자일리톨 1, 10, 30, 50, 그리고 100mM을 각각 투여하여 대조군과 비교 분석하였다. 먼저, 형성된 TRAP양성 파골세포 수를 계수한 결과 공존 배양계와 RAW 264.7 모두에서 자일리톨 농도 증가에 비례하여 핵이 3개 이상인 파골세포 수가 점차 감소하였다. 또한 bone slice상에서 골 흡수 능력을 비교한 결과에서도 감소하였다. 세포 독성능 검사 결과 자일리톨 50mM 이하에서는 독성이 없었다.

자일리톨의 파골세포분화 억제 기전을 규명하기 위하여 조골세포에서 골흡수 기전의 중요 Cytokine인 골흡수 촉진인자 (RANKL)와 골흡수 억제인자(OPG)의 mRNA 양(by RT-PCR)과, 최종 생산된 단백질의 양(by ELISA)을 측정하였다. 그 결과 자일리톨 농도가 증가 함에 따라 RANKL 및 mRNA 양이 점차적으로 감소하였다. 반면에 OPG 에는 변화가 없었다. 자일리톨이 조골세포 뿐 아니라 파골세포에도 직접 작용하는지 알아 보고자 RAW 264.7을 이용하여 파골 세포로 분화된 다핵세포 수를 계수한 결과, 그 숫자 또한 자일리톨 농도가 증가 함에 따라 점차 감소하였다. RAW264.7에서 세포내 신호전달 물질 중 하나인 JNK와 ERK를 Western blot을 이용하여 조사 하였다. 자일리톨을 투여한 결과 활성형인 p-JNK와 p-ERK가 대조군에 비해서 감소하였다.

결론적으로 자일리톨은 조골세포에서 골 흡수 촉진인자인 RANKL의 발현을 억제하고 파골세포 내에서 신호 전달 물질인 JNK와 ERK의 활성을 감소 시킴으로써 파골세포 분화를 억제하였다

[영문]Xylitol has a variety of functions to cells, such as bacteriostatic, and anticariogenic effects. However, understanding of cellular mechanism for the role of xylitol on bone metabolism remains to be solved. In this study, the physiological role of xylitol in osteoclastogenesis was exploited in a co-culture system and RAW 264.7 cell. Xylitol reduced the number of tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) positive multinucleated cells. The number of multinucleated osteoclast cell not only in co-culture system but also in RAW 264.7 cell exposured to medium containing 1, 10, 30, 50, and 100 mM of xylitol was reduced in a dose dependent manner. Bone resorption activity, which was performed on the bone slice in co-culture system, was dramatically decreased as xylitol concentration increasing. According to the viability test, there was no cellular damage at up to 100 mM of xylitol. In order to investigate the mechanism by which xylitol inhibits osteoclastogenesis, the mRNA expressions of receptor activator of NF-B ligand (RANKL) and osteoprotegerin (OPG) were analyzed by RT-PCR. Exposure of osteoblastic cells to a medium containing of xylitol reduced RANKL mRNA expression induced by 10-8M 1, 25(OH)2D3 in a dose-dependent manner. In addition, RANKL and OPG protein were also analyzed with ELISA using anti-RANKL and anti-OPG antibody. The expression of RANKL was decreased with the increase of xylitol concentration. The amount of OPG was slightly increased in the presence of xylitol, but there was no statistically significant difference. Nonetheless these results imply that xylitol inhibits osteoclast differentiation by reducing RANKL/OPG ratio in osteoblast. Also, we found that the phosphorylation of c-Jun NH2-terminal Kinase (JNK) and Extracellular Signal-regulated Kinase(ERK), which regulates the activity of various transcriptional factors, was reduced by xylitol treatment in RAW 264.7 cells.

Conclusively, these findings suggest that xylitol down-regulates the 1α,25(OH)2D3- induced osteoclastogenesis via partly modulation of RANKL/ RANK/ OPG regulatory axis and the decrement of phosphorylation of MAPK in preosteoclast.