Calcyclin, a Ca2+ion binding protein, plays a role for anabolic effects of simvastatin on bone

Abstract

[한글]

스타틴은 강력한 HMG-CoA reductase 억제제로서 사람과 동물에서 콜레스테롤의 합성을 억제하는 약제로 알려져 있다. 선행된 연구에 의하면 임상적으로 쓰이고 있는 양만으로도 in vitro 실험에서 골 형성능을 촉진하는 것으로 보고되었다. 이에 심바스타틴에의한 조골세포의 동화작용 유도 매개체를 찾고자 하며 프로테오믹스 기법을 이용하여 이를 동정하고자 본연구를 수행하였다. 생후 하루된 마우스의 두개관(頭蓋冠)에서 조골세포를 얻었으며 이후 10-9~`10-6 M 농도의 심바스탄틴을 처리하였다. 증식실험을 위해 스타틴은 이틀에 6시간만을 간헐적으로 처리 하였고, 총 8일 동안 반복하였다. 친지질성 스타틴은 세포내에서 세포를 안정화 하거나 증식을 억제시키는 등의 작용을 하므로, 단기간 처치 방법을 택하였으며, 배지 성분도 Fetal Bovine Serum이 아닌 1% Bovine Serum Albumin 성분이 포함된 α-MEM을 택하였다. 조골세포의 증식은 스타틴 처리 농도에 의존적으로 증가하였으며 이는 대조군 대비하여 통계학적으로 의미 있는 값을 보여주었다. 또한 심바스타틴이 조골세포의 분화에 미치는 영향은 조골세포 분화 마커들의 표현정도를 RT-PCR로서 확인하고자 하였다. ALP, Type I Collagen 그리고 osteocalcin으로 확인하였고, 조골세포 분화 또한 심바스타틴 처리 농도에 의존적으로 현저한 증가를 보였다. 심바스타틴을 처리하지 않은 대조군과 10-7 M 로 6시간 처리한 실험군에서 단백질을 얻어서 프로테오믹스를 시행하였다. 2차원적으로 분리된 단백질 양상은 PDQuest 소프트웨어로 분석되었으며 이후에 선별적으로 6개의 단백질이 MALDI-TOF로 동정되었다. 이중 칼사이클린은 심바스타틴에 의해 10배 이상의 높은 증가를 보였으며 mRNA 수준에서도 심바스타틴에 의해 그 발현이 촉진됨을 확인하였다. GFP-cacy fusion 단백질을 만들어 세포내 칼사이클린의 위치를 확인하였다. 심바스타틴을 20분 처리시 빠르게 그 위치가 cytoplasm에서 핵쪽으로 이동하였음을 confocal 현미경으로 확인하였다. 또한 조골세포에 있어 칼사이클린의 작용을 연구하기 위해 pcDNA-cacy 재조합 유전체를 만들어 MC3T3-E1 세포에 과발현 시켜 보았다. 이때 조골세포의 증식은 물론 첫단계 분화마커인 ALP가 현저하게 증가되었다. 결론적으로, 심바스타틴은 조골세포의 증식과 분화를 모두 촉진하였으며 이때 칼사이클린은 심바스타틴의 조골능 유도에 있어 일부 중요한 역할을 할 것으로 사료되었다.

[영문]

Simvastatin is a pro-drug of a potent 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) reductase inhibitor and inhibits cholesterol synthesis in humans and animals. In the previous studies, in vitro treatment of pharmacological dose of simvastatin stimulated bone formation. To identify the mediators of the anabolic effects of simvastatin on osteoblasts, we tried to identify and characterize simvastatin-induced proteins by using proteomic analysis. Simvastatin stimulated the proliferation of primary cultured osteoblast cells significantly even at the lowest concentration(10-9 M) after 6 hour exposure, and the expression of osteoblast differentiation markers such as alkaline phosphatase (ALP), type I collagen and osteocalcin in the presence of simvastatin was remarkable in dose-dependant manner. Calcyclin was up-regulated more than 10 times, and annexin I, III, vimentin and tropomyosin, were also up or down regulated by simvastatin significantly. Up-regulated calcyclin mRNA by simvastatin was validated by reverse transcription in mouse calvarial cells. In confocal microscope analysis, GFP-cacy fusion protein was visualized in cytoplasm of MC3T3-E1 cells transfected with GFP-calcyclin cDNA containing plasmid and quickly shifted to the nucleus 20 min after simvastatin treatment. The rate of ALP mRNA expression and proliferation were significantly increased without exposure to simvastatin in MC3T3-E1 cells overexpressing calcyclin cDNA. In conclusion, simvastatin stimulates the proliferation and early differentiation of osteoblast. Calcyclin is one of the candidate proteins playing a role in osteoblastogenesis in response to simvastatin, although the precise functions of calcyclin in osteoblast remain unknown.