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삼차원 배양에서 doxycycline 처리에 의한 인체 진피 섬유모세포의 제 1형 교원질 생합성과 matrix metalloproteinase-1의 발현

Other Titles
 Doxycycline effect on type I collagen synthesis and MMP-1 expression in three- 
Issue Date
2003
Description
의과학과/석사
Abstract
[한글] 생체의 손상부위를 그 본래의 조직으로 회복시키는 재생과정에서 실질세포의 재생능력과 교원질을 비롯한 세포외 기질의 형성이 필수적이다. 따라서 의학 및 조직공학에서 세포외 기질의 가장 중요성분인 교원질의 합성에 대한 필요성이 강조되고 있다. 현재 적용되고 있는 교원질의 대부분이 가축 및 사체에서 얻어지며, 이는 면역반응 및 감염 등의 우려가 있어, 이를 대체할 수 있는 사람 교원질을 in vitro에서 생합성하는 것의 중요성이 대두되고 있다. 본 연구는 사람의 성숙한 제 1형 교원질을 in vitro상에서 얻기 위한 목적으로 인체 진피 섬유모세포를 삼차원 배양하여 사람의 교원질을 생합성하였고, 인체 진피 섬유모세포의 삼차원 배양에서 doxycycline 처리로 인해 제 1형 교원질의 합성과 matrix metalloproteinase-1(MMP-1) 발현에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 삼차원 배양을 위하여 poly-lactic-co-glycolic acid(PLGA) 지지체를 이용하였고, 이 과정에서 장기간의 삼차원 배양 시 MMP-1에 의한 제 1형 교원질의 분해를 억제하기 위하여 MMP 억제제로 알려진 doxycycline을 처리하였다. PLGA 지지체 내에 축적된 교원질은 산과 염의 침전법으로 추출하였으며, 이를 전자현미경적 관찰과 제 1형 교원질 western blot anaylsis를 통해 분석하였다. 또한 doxycycline의 억제 효과가 어느 단계에 영향을 미치는지 파악하기 위하여 RT-PCR, western blot analysis와 zymography를 시행하였다. 결과는 다음과 같다. 1. 인체 진피 섬유모세포를 PLGA 지지체내에서 삼차원 배양하여 추출한 결과 성숙한 제 1형 교원질을 얻을 수 있었다. 2. 삼차원 배양에서 MMP-1의 발현을 반으로 억제하는 농도(IC50)인 200μM의 doxycycline을 6주간 처리한 결과, 대조군에 비해 제 1형 교원질의 합성량이 증가되었다. 3. PLGA 지지체 내에서 인체 진피 섬유모세포를 삼차원 배양한 결과, 단층 배양에서보다 MMP-1의 발현 양이 증가되었으며, 활성도를 지닌 형태가 발현되었고, doxycycline을 처리한 결과, MMP-1의 발현이 감소되었다. 4. Doxycycline의 MMP-1 억제기전을 파악한 결과, mRNA 및 pro-MMP-1 발현을 억제하는 단계보다, 효소의 활성도를 낮추는 기작을 통해 MMP-1이 억제되었다. 이상의 연구 결과로 MMP 억제제인 doxycycline의 장기간 처리는 지지체 내에 축적된 교원질의 분해를 억제함으로써 교원질의 합성을 증가시키며, PLGA 지지체를 통한 장기간의 삼차원 배양은 인체 진피 섬유모세포로부터 성숙된 사람의 교원질을 합성하여 추출해 낼 수 있었다.
[영문] Tissue regeneration of the wounds requires the proliferative capacity of parenchymal cells accompanied by the supports of extracellular matrix, in particular collagen fibers. Therefore, collagen synthesis has been one of the target fields in regeneration medicine and tissue engineering. Collagen products extracted from bovine or porcine tissues are widely used for support in medical and tissue engineering. However, they may cause immune response and may transfer pathogens to the recipient tissue. In order to solve these problems, we aimed to synthesize mature collagen derived from human dermal fibroblasts and in particular, focused on the up-regulation of collagen synthesis by long-termed three-dimensional culture with the treatment of doxycycline, a MMP inhibitor. Human dermal fibroblasts were cultured on PLGA scaffold and they were treated with doxycycline to inhibit MMP-1 activity. Type I collagen was extracted by acid solution and salt precipitation and it was quantitative by western blot analysis. In addition, we determined the direct and indirect mechanisms by which doxycycline can inhibit matrix metalloproteinase (MMP) activity using RT-PCR, western blot analysis and zymography. 1. Mature human collagen was obtained by long-term three-dimensional culture of skin fibroblasts in PLGA scaffold. 2. Type I collagen synthesis was increased in three-dimensional culture by 200μM doxycycline treatment for 6 weeks. 3. MMP-1 was expressed in latent form in skin fibroblast monolayers, whereas it was expressed predominantly in active form in the three-dimensional cultures. MMP-1 expression in the three-dimensional culture was approximately 2.5 times higher than that of the monolayer culture, and its expression was markedly reduced by doxycycline treatment. 4. MMP-1 inhibition by doxycyline treatment was induced by the inhibition of enzyme activity, rather than the degradation of the pro-MMP zymogen or the suppression of MMP-1 mRNA transcription. In summary, mature human type I collagen was obtained by long-term three-dimensional culture of human dermal fibroblasts in PLGA scaffold and its yield was increased by long-term treatment of doxycycline.
URI
http://ir.ymlib.yonsei.ac.kr/handle/22282913/128387
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2. 학위논문 > 1. College of Medicine (의과대학) > 석사
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