간 재생 과정 중 혹스 유전자 및 단백질의 발현 패턴 분석

Abstract

[한글]

인간은 비교적 세포교체가 느리게 이루어지는 기관이지만 손상을 입거나 제거될 경우 스스로 재생하는 능력이 있다고 알려져 있다. 과학적인 간 재생에 대한 실험 모델은 1931년 Higgins와 Enderson이 흰쥐간의 2/3정도를 부분 절제한 후 재생 과정을 확인한 보고가 있다. 재생이란 단순한 세포증식을 의미하는 것이 아니라 손상된 부분이 손상 전과 같은 형태를 형성하며 회복되는 것으로써 성체에서 일어나는 또 다른 형태의 발생이라고 볼 수 있다. Hox 유전자는 발생을 조절하는 유전자 중 하나로 척추동물과 무척추동물에 있어서 초기 배 발생 시 특정한 시기에 특정한 장소에서 발현하며, 몸통 전·후 축의 형태를 형성하는데 있어 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 이제까지의 간 재생에 관한 연구들은 모두 세포 증식과 관련된 연구이고, 간 재생 과정 중 그 형태가 형성되는 것에 대한 연구는 미약하다. 따라서 본 연구에서는 간 재생 과정동안 Hox 유전자의 발현 패턴을 분석하여 Hox 코드를 유추해보고 또 2-Dimentional Elelctrophoresis(2-DE)와 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight(MALDI-TOF)를 수행하여 재생에 관여하는 단백질을 분석하고자 하였다. 간을 부분 절제하고 봉합한 후 0시간, 4시간, 3일이 경과한 간 조직에서 총 RNA를 분리하였다. PCR과 cloning을 수행하여 얻은 클론들의 염기서열을 분석한 후 BLAST search를 통해 상동성이 있는 유전자를 찾았다. ① 재생 0시간, 4시간, 3일 별로 발현이 증가하는 유전자는 Hoxb1, 그리고 Hoxd3, ② 발현이 감소하는 유전자는 Hoxa1, 그리고 b8, ③ 재생 4시간과 3일에서만 발현하는 유전자는 Hoxa9, a10, b2, b5, d1, 그리고 d4, ④ 재생 4시간에서만 발현하는 유전자는 Hoxb4, c5, c9, c10, 그리고 d9, ⑤ 재생 3일에서만 발현하는 유전자는 Hoxb3, b9, 그리고 d12로 분석되었다. 여기에서 paralogous group 9와 10에 속하는 유전자(Hoxa9, a10, b9, c9, c10, 그리고 d9)가 stage specific 하게 재생 과정 중 특이적으로 발현하는 것을 알 수 있었다. 그리고 paralogous group 1에 속하는 Hoxa1과 b1의 경우 재생 전·후에 계속 발현하는 것으로 관찰되었다. 이것으로부터, paralogous group 9와 10은 재생 단계에 특이적으로 발현하는 유전자들로, 또 Hoxa1과 b1은 일반적인 간 특이적 유전자들로 유추할 수 있다. 단백질을 분석한 결과 재생 4시간째에 과 발현하는 단백질 중 Hoxd10이 그리고 3일째 과 발현하는 단백질로서 Hoxa10과 d3이 분석되었다. 이들의 발현 패턴은 흥미롭게도 RNA 수준에서의 분석 결과와 일치함을 확인하였다.이상의 결과를 바탕으로 Hoxa10과 d10을 포함하는 paralogous group 9와 10의 유전자와 Hoxd3가 재생 단계에 특이적으로 발현하는 유전자들임을 추측할 수 있었다.

[영문]

Liver is an organ with relatively slow cell replacement, but it is known to have an ability to regenerate by itself when it is damaged or removed. For a scientific experiment model regarding liver regeneration, there is a report by Higgins and Enderson in 1931 investigating the regeneration process after 2/3 of a rat liver was removed. Regeneration means recovering the shape prior to the damage, not just the simple multiplication of cells and can be regarded as another form of generation occurring in an adult organism. Hox gene is one of the genes controlling generation and manifests itself at a certain time at a certain place during early embryonic stage. It is known to have an important role in forming the axis of the body distinguishing the front and the back. Research on the liver regeneration so far was regarding cellular multiplications, and the research on the formation of the shape during liver regeneration process has been scarce. This research intends to infer the Hox code by analyzing the expression patterns of the Hox genes during liver regeneration and to analyze the proteins involved in regeneration by performing 2-Dimentional Electrophoresis (2-DE) and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight (MALDI-TOF). RNA has been separated from the liver tissue at the time of partial hepatectomy, 4 hours later and 3 days later. Gene sequence obtained by performing PCR and cloning has been analyzed, and homologous genes were sought through BLAST search.Genes belonging to paralogous group 9 and 10 (Hoxa9, a10, b9, c9, c10, and d9) manifested themselves in a peculiar way during regeneration process with stage specific characteristics. Also, the Hoxa1 and b1 of paralogous group 1 manifested themselves continuously before and after regeneration. The result of the protein analysis showed Hoxd10 overexpressing at 4 hours of regeneration and Hoxa10 and d3 overexpressing at 3 days of regeneration. Interestingly, the pattern of protein expression matched the result of RNA level analysis. Based on the above results, Hoxd3 and paralogous group 9 and 10 genes including Hoxa10 and d10 seemed to be a related genes during regeneration steps.