Artificial nuclear receptor와 target reporter의 개발 및 특성 규명

Abstract

[한글]

특정 유전자의 생리적인 기능을 연구하는 기초연구나 유전자치료 같은 응용연구에 사용하기 위한 inducible expression system을 개발하기 위하여, 기존의 GAL4 DNA binding domain (DBD)을 이용한

inducible expression system을 개량한 artificial nuclear receptor와 target reporter를 개발하였다. 현재 다양한 종류의 inducible expression system이 개발 되었는데, 그들 대부분은 유전자의 발현을 특정ligand로 조절하기 위해 prokaryote나 eukaryote에서 유래된 ligand binding domain (LBD)을 사용하며,

activation domain (AD)으로 herpes simplex virus의 VP16 AD를 주로 사용한다. 새로이 개발한 inducible expression system에서 artificial nuclear receptor는 yeast의 GAL4 DBD와 human

progesterone/estrogen receptor LBD, SREBP1a의 AD를 사용하였다. Estrogen receptor LBD의 경우에 estrogen과 anti-estrogen인 4-OHT (hydroxytamoxifen)이 모두 결합하지만, human progesterone receptor LBD의 경우 C-terminal 말단의 892-933 아미노산을 제거하여 progesterone과는 결합하지 않고 progesterone antagonist인 RU486 (mifepristone)에만 특이적인 반응을 나타내게 한 LBD를 사용하였다.

Reporter gene은 GAL4 response element (RE)를 5번 반복한 부위와 ACL minimal promoter -60/+67, luciferase gene을 연결하였다.

새로 개발한 inducible expression system은 두 가지 개선점이 있었다. 첫째로, artificial nuclear receptor에 SREBP1a AD을 사용함으로써 유전자발현을 더욱 활성화 시킬 수 있었고 둘째로, reporter gene의 promoter인 minimal TATA-box를 ACL minimal promoter -60/+67로 대체시키고, 여기에 SV40 enhancer를 연결하여 유전자의 발현을 더욱 증가 시킬 수 있었다. 이러한 개량된 inducible expression system은 exogenous gene의 기능을 연구하는 기초연구나 유전자치료 같은 응용연구에서 매우 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

[영문]

To develop an inducible expression system for use in basic research and applied research, we generated the artificial nuclear receptor and target reporter. A number of ligand-regulated artificial nuclear receptor have been generated by various means, using ligand binding domain (LBD) derived

from either prokaryotes or eukaryotes, and activation domain (AD) derived from herpes simplex virus.

In our inducible expression system, the artificial nuclear receptor contains the yeast GAL4 DNA binding domain, LBD of human progesterone/estrogen receptor and SREBP1a AD. The estrogen

receptor LBD bind to estrogen and anti-estrogen (4-OHT). But progesterone receptor LBD specifically bind to anti-progesterone (mifepristone, RU486) instead of endogenous hormone. The target

reporter construct contains the five copies of GAL4 responsive element, ACL minimal promoter -60/+67 and luciferase gene. In the presence of ligand, artificial nuclear receptor specifically activates the expression of luciferase gene.

Two major improvements of this system were made. First, artificial nuclear receptor GAL4-PR/ER was rendered more potent by fusing the strong activation domain, SREBP1a AD. Second, target reporter gene expression was more increase by replaced minimal TATA box promoter with ACL minimal promoter -60/+67, and fusing the SV40 enhancer. This enhanced inducible expression

system can restrict its specificity to the target gene, and enable to provide powerful tools that may be applied to the study of exogenous gene function and gene therapy.