신경세포에서 TNF-α에 의한 NF-κB 활성화를 억제하는 zinc의 표적

Abstract

[한글]

NF-κB는 뇌졸중, 알쯔하이머 병, 파킨슨 병 등을 포함한 중추 신경계 여러 퇴행성 신경질환이나 그 밖의 많은 신경질환에 관련되어 있음이

보고되어있다. TNF-α는 NF-κB를 활성화시킴으로써 염증반응에서 중요한 역할을 한다. 우선 TNF-α가 그 수용체(TNF receptor, TNF-R)와 결합하면 TNF-α 수용체는 몇몇 단백질을 끌어들여 TNF-R 신호전달 복합체를 형성한다. 두 종류의 TNF-R 중 TNF receptor 1 (TNF-R1) 신호전달 복합체를 구성하는 단백질로는 TNF receptor-associated death domain-containing protein (TRADD), TNF receptor-associated factor 2 (TRAF2)와 death domain kinase receptor-interacting protein (RIP) 등이 있다. TNF-α가 수용체와 결합하면 TNF-R1에 TRADD가 각각의 death domain을 통해 결합하며, 또한 RIP도 death domain을 가지고 있어 TRADD를 통해 TNF-R1에 결합한다. 또한 TRAF2는 TRADD에 결합되며 계속적으로 NF-κB interacting kinase (NIK)와 IκB kinase (IKK)가 TRAF2에 결합되어 TNF 수용체 신호전달 복합체가 구성된다./

Pyrroldine dithiocarbamate (PDTC)는 NF-κB의 억제제로 기저의 NF-κB의 활성뿐 아니라 TNF-α에 의해 유도된 NF-κB의 활성도 억제한다. 우리는 이전에 PDTC가 zinc의 이온운반체이며, zinc를 매개로 하여 NF-κB를 억제한다고 보고한 바 있다. 그래서 이번 실험에서 TNF 수용체 신호전달 복합체에 미치는 zinc의 효과를 PDTC를 사용하여 신경모세포종에서 유래된 세포주인 SH-SY5Y에서 실험하였다. /

SH-SY5Y 세포에서 TNF-α에 의한 NF-κB의 활성은 zinc에 의해 억제되었고, IκB-α에 대한 IKKα와 IKKβ의 활성도 zinc에 의해 모두 억제되었다. Zinc는 TNF-α에 의한 IKK의 인산화도 억제하는 것으로 보아 TNF-α에 의한 신호전달 경로중 IKK보다 상위의 단계에 작용할 것으로 생각하였다. / SH-SY5Y 세포에서 TNF-α에 의한 IκB-α의 인산화는 TNF-R1에 의해 억제되었으나 TNF-R2에 의해서는 억제되지 않았다.

즉, SH-SY5Y 세포에서 TNF-α에 의한 IκB-α의 인산화는 TNF-R1을 통한 경로임을 확인하였다. Anti-TRAF2 항체를 이용한 면역침전을 통해 TRAF2와 부착되어 상호작용하는 단백질들을 분리하여 Western blot을 수행한후 단백의 상호작용에 대한 zinc의 효과를 관찰하였다. 그 결과, zinc는 TNF-R1에 TRAF2가 부착되는 것을 억제하였고, TRAF2에 RIP, NIK, IKKα,β가 부착되는 것도 억제하였다. TNF-R1, TRADD 및 TRAF2들의 상호작용에 대한 zinc의 효과를 관찰하기 위하여 이들을 둘씩 함께 transfection시킨 후 면역침전으로 확인하였다. TRADD와 TRAF2사이의 상호작용은 zinc에 의해 억제되었으나 zinc는 death domain-death domain 상호작용으로 결합되는 TNF-R1과 TRADD의 상호작용은 억제를 하지 못하였다. / 이상의 결과들로 zinc가 TNF-α에 의한 NF-κB 활성화를 억제하는 것은 TNF-R1 신호전달 복합체를 이루고 있는 여러 단백 중 TRADD와 TRAF2사이의 결합을 억제하여 TNF-α에 의한 NF-κB 활성이 감소되는 것이라 생각된다.

[영문]

Inflammation is involved in the pathophysiology of many CNS diseases, such as stroke, Alzheimer''s disease, Parkinson''s disease etc. TNF-α plays a key role in inflammation through the activation of NF-κB in neurons. In response to the TNF-α, TNF-α receptor recruits several proteins to form a TNF receptor signaling complex. . The components of the TNF receptor(TNF-R) signaling complex are TNF receptor-associated death domain-containing protein(TRADD), TNF receptor-associated factor 2(TRAF2) and death domain kinase receptor-interacting protein(RIP).

RIP and TRAF2 bind to TRADD which is recruited to death domain of TNF-R1 via its death domain. Subsequently, NIK and IKK recruitment to TRAF2 ensued. IKK is quickly activated by TNF-α,

which correlates with IKK recruitment to the TNF receptor signaling complex. PDTC is a NF-κB inhibitor that inhibits both the basal and the TNF-α-induced NF-κB activation. We have previously reported that PDTC is a zinc ionophore and the NF-κB inhibition by PDTC is mediated by zinc. In this study, therefore, we investigated the effects of zinc using PDTC on the TNF receptor signaling complex in the SH-SY5Y human neuroblastoma cell line. We reconfirmed that TNF-α activated NF-κB through the type 1 TNF receptor(TNF-R1), not through the type 2.

The complex was immunoprecipitated with TRAF2 first and interacting proteins were identified by Western Blot. TRAF2 immunoprecipitated TNF-R1, IKKα,β, NIK and RIP upon stimulation of TNF-α.

Zinc inhibited the recruitment of TNF-R1 to TRAF2. Zinc also inhibited the recruitment of IKKα,β, NIK, RIP to TRAF2. TNF-R1, TRADD and TRAF2 were trasfected and overexpressed in SH-SY5Y cells and the effect of zinc on TNF-R1-TRADD-TRAF2 complex were studies in these cells.

In this experiment, zinc inhibited the recruitment of TRAF2 to TRADD but not TRADD to TNF-R1.

From these results, it could suggested that zinc would inhibit TNF-α-induced NF-κB activation through the inhibition of the recruitment of TRAF2 to TRADD