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BMP-2에 대한 인간 추간판 세포의 기질 생성 반응

Other Titles
 Matrix synthesis of human intervertebral disc cells in response to human recombinant bone morphogenetic protein-2. 
Issue Date
2002
Description
의학과/석사
Abstract
[한글] 성장 인자 및 유전자 전달체로서 바이러스가 소개되면서 추간판 조직의 기질 생성을 자극하기 위한 치료적 유전자 전달이 가능해졌다. BMP-2는 관절 연골 혹은 성장판 연골에서 연골 분화, 표현형 유지의 중요한 인자로 알려져 있으며 주로 골유합 내지는 척추 유합을 유도하는 성장 인자로 실험 및 임상에서 널리 사용되고 있다. 본 연구에서는 BMP-2를 제조하고 제조된 BMP-2를 인간의 추간판 세포에 투여함으로서 BMP-2에 의한 인간 추간판 세포의 생물학적 기질 생성 특히 연골성 기질 생성 반응을 알아보았다. 추간판 술식을 시행한 6명의 환자에서 수술중 추간판 수핵부 조직을 채취하여 고형화된 alginate gel-세포 방울 내에서 삼차원적으로 배양하고 진핵 세포 유전자 발현 plasmid DNA인 pcDNA3.1/hygro vector를 이용하여 인간 BMP-2A의 유전자를 재조합한 후 여러 농도 의 rhBMP-2를 추간판 세포에 투여하고 새로 생성된 당단백을 측정하였을 때 대조군의 당단백 생성에 비해 50ng/ml부터 의미 있는 당단백 생성 증가가 관찰되며, 300ng/ml 농도에서는 50%, 1000ng/ml 농도에서는 100%, 1500ng/ml 농도에서는 250%의 당단백 생성 증가가 관찰되었다. Aggrecan, 제 1형 교원질, 제 2형 교원질 mRNA 발현을 RT-PCR 산물의 densitometry로 분석하면 rhBMP-2의 농도에 비례해서 각 유전자의 mRNA 발현은 증가하였다. 제 I형 교원질 mRNA는 rhBMP-2 100ng/ml 농도의 경우 대조군에 비해 70%의 발현 증가가 있었고 제 2형 교원질 mRNA의 경우는 같은 농도의 rhBMP-2에서 50%의 발현 증가가 있었다. 특히 aggrecan mRNA는 대조군에 비해 rhBMP-2 1500ng/ml의 농도에서는 400%의 발현 증가가 있었다. 이에 반해서 osteocalcin mRNA의 발현은 rhBMP-2의 농도에 관계없이 대조군과 비교해 차이 가 없었다. 여러 농도의 rhBMP-2를 추간판 세포 배양군에 투여하고 3일, 7일, 11일간 배양 후 aggrecan, 제 1형 교원질, 제 2형 교원질의 발현을 측정하면 초기 3일간은 강하게 발현되나 배양 기간이 경과할수록 발현의 강도는 감소하였다. Aggrecan mRNA는 제 1형 교원질, 제 2형 교원질에 비해 배양 기간이 길어져도 발현을 비교적 높게 유지하였다. 이상의 결과로 미루어 rhBMP-2는 인간의 추간판에서 골형성 보다는 당단백과 추간판 기질 생성을 효과적으로 유도하므로 rhBMP-2를 이용한 치료적 유전자 전달이 인간의 퇴행성 추간판 질환의 치료에 유용한 방법임을 시사한다.
[영문] Recent advancements in molecular biology, recombinant DNA technology and the cloning of genes, have enabled scientists to obtain sufficient amounts of pure gene products for experimental and clinical use. The introduction of the growth factor and gene transfer virus makes the therapeutic gene transfer to promote the production of the matrix of intervertebral disc chondrocytes possible. Bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) has been known to be an important factor in differentiation and maintenance of phenotype of the chondrocytes of the articular cartilage or physeal plate. BMP-2 is also used as a growth factor to induce vertebral bone union or vertebral fusion in vitro or in clinical treatments. The author reproduced and added BMP-2 into the human intervertebral disc chondrocytes in vitro and analyzed the reactional production of the biological matrix, especially the matrix from the human intervertebral disc chondrocytes. The intervertebral disc cells were harvested from the surgical patients for the degenerative vertebral disease. The cells were cultured in 3-dimensional alginate-gel beads and different doses of the recombinant human bone morphogenetic protein-2 (rhBMP-2) was added. The amounts of aggrecan from the human intervertebral disc chondrocytes increased significantly from the minimum dose (50ng/ml) of rhBMP-2, by 50% with 300ng/ml, by 100% with 1000ng/ml and by 250% with 1500ng/ml compared to the control culture. The effect of rhBMP-2 on mRNA expression for aggrecan, collagen type-I and collagen type-II was also increased proportional to the different doses of rhBMP-2 compared to the control culture. The expression of mRNA for collagen type-I increased by 70% in culture treated with rhBMP-2 and collagen type-II by 50%. Especially, the expression of mRNA increased by 400% with 1500ng/ml of rhBMP-2. In contrast, The expression of mRNA for osteocalcin was similar to that of the control culture regardless of the amounts of rhBMP-2. The results of separate dose-response for chondrocyte aggrecan, collagen type-I and collagen type-II were assesed after 3, 7 and 11 days of culture. The expression of mRNA for chondrocyte aggrecan, collagen type-I and collagen type-II after 3 days in culture demonstrated nearly maximal synthesis and decreased thereafter. Aggrecan mRNA expression was maintained higher than collagen mRNA expression even though the time elapsed. The results of this study show that rhBMP-2 promoted the phenotype of human inververtebral disc chondrocyte in 3-dimensional cell culture. Synthesis of normal chonndrocyte matrix components was increased in culture treated with rhBMP-2 but rhBMP-2 did not induce differentiation to a hypertrophic phenotype and osteocalcin synthesis. This characteristics may show a potential usefulness of rhBMP-2 in treatment of the degenerative human vertebral disease or osteoarthritis.
URI
http://ir.ymlib.yonsei.ac.kr/handle/22282913/128093
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2. 학위논문 > 1. College of Medicine (의과대학) > 석사
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