구강 편평세포암종에서 TGF-β1 type Ⅱ 수용체의 돌연변이

Abstract

[한글]

상피세포는 상피성장인자와 억제인자의 균형에 의해 항상성이 유지되며, 따라서 인체에 발생하는 상피 암종의 발생기전은 상피세포 성장인자와 억제인자의 불균형에 따른 결과로 설명되고 있다. TGF-β1은 상피세포의 성장을 억제하는 인자로서 여러 암종에서 TGF-β1 수용체의 발현감소 및 TGF-β1 type Ⅱ 수용체 유전자의 돌연변이가 알려져 있다. 그러나, 암종 발생부위와 유형에 따라 유전자 돌연변이와 발현정도는 매우 다양하다. 이에 저자는 구강 편평세포암종에서 TGF-β1 수용체의 발현 및 TGF-β1 type Ⅱ 수용체 유전자의 돌연변이 여부를 알아보고자 하였다. 연구 재료로는 연세대학교 치과대학 구강병리학교실에서 확립한 6 예의 구강 편평세포암종 세포주를 이용하였다. 연구 방법으로는 돌연변이를 관찰하기 위하여 phenol-chloroform 방법에 의해 DNA를 추출하여 수용체 유전자의 exon 3, 4, 5, 6에 대해 중합효소 연쇄반응을 시행하였고, 반응산물을 클로닝 벡터(pGEM-T easy vector)에 삽입하여 자동화된 DNA 염기서열 분석기로 분석하였다. TGF-β1 type Ⅱ 수용체의 mRNA 발현을 알아보고자 역전사-중합효소 연쇄반응을 시행하였으며, TGF-β1 type Ⅱ 수용체의 단백질 발현을 알아보기 위하여 면역조직화학 검색을 시행하였다. 또한, MTT 검사로 구강 편평세포암종 세포주에서 TGF-β1의 세포성장 억제효과를 조사하였다.

이 연구의 결과는 다음과 같다.

1. YD-8 세포주에서 TGF-β1 type Ⅱ 수용체 유전자의 세포외 영역(extracellular domain)의 exon 3, codon 125 부위에서 한 개의 adenine이 탈락한 frameshift를 관찰하였다.

2. YD-17 세포주에서 type Ⅱ 수용체 유전자의 세포내 영역(intracellular domain)의 exon 4, codon 238 부위에서 아미노산 asparagine이 aspartic acid(A:T→G:C)로 바뀐 missense 변이를 관찰하였다.

3. YD-10B 세포주의 exon 4의 codon 168, 206 및 YD-17M 세포주의 exon 6, codon 475 부위에서 silent 변이를 관찰하였다.

4. 모든 세포주의 exon 5, codon 439 부위에서 아미노산 변화(Ala→Val)를 관찰하였다.

5. 역전사-중합효소연쇄반응 결과 모든 세포주에서 TGF-β1 type Ⅱ 수용체의 mRNA가 다소 감소되는 발현상을 보였다.

6. 면역조직화학 염색에서 TGF-β1 type Ⅱ 수용체 단백질이 모든 세포주의 생검조직 표본에서 발현되었다.

7. MTT 검사 결과 YD-8과 YD-17M 세포주를 제외한 4 예의 세포주에서 TGF-β1의 세포증식 억제효과의 감소상을 관찰하였다.

이상의 연구 결과 6 예의 구강 편평세포암종 세포주에서 2 예의 돌연변이가 관찰되었고, mRNA 발현이 감소하였다. 따라서 TGF-β1 type Ⅱ 수용체의 변화를 구강 편평세포암종 발생과정에서 확인하였지만, TGF-β1 type Ⅱ 수용체의 유전자 돌연변이의 역할 규명이 필요할 것으로 생각한다.

[영문]

It is well known that the imbalance between epithelial cell growth and inhibitory factors may cause human epithelial cancer. The dysregulation of growth inhibitory effect of TGF-β1 has been recognized in a variety of carcinomas. This study aimed to investigate the role of TGF-β1 in the carcinogenesis of oral squamous cell carcinoma(OSCC). 6 cell lines established from OSCC in the department of Oral Pathology, Yonsei University College of Dentistry were used. DNA was extracted from harvested cells by phenol-chloroform method. Polymerase chain reaction (PCR) was

done with each primer of exon 3, 4, 5, 6 of TβR-II (TGF-β1 type II receptor) gene. PCR products were inserted to cloning vector (pGEM-T easy vector) and then analyzed to automatic DNA sequencing analyzer. Reverse transcriptase-PCR (RT-PCR) was performed to confirm the mRNA expression of TβR-II gene. Immunohistochemical staining was performed to detect the expression of the TβR-II protein. MTT assay was performed to examine the growth inhibitory effect of TGF-β1 in OSCC cell

lines.

The results were as follows :

1. A frameshift within a polyadenine region of exon 3 was found in YD-8 cell line.

2. In YD-17 cell line, a missense mutation at codon 238 of exon 4 was found, suggesting the alteration of amino acid from asparagine to aspartic acid.

3. YD-10B showed the silent mutation of codon 168 and 206 of exon 4. YD-17M also showed a silent mutation at codon 475 of exon 6.

4. All 6 cell lines showed the mutation of codon 439 of exon 5, which is disclosed as genetic polymorphism.

5. TβR-II mRNA was detected in all cancer cell lines, but it was slightly decreased as compared to that of normal oral mucosal cells.

6. In immunohistochemical staining, TβR-Ⅱ protein was expressed positively in all squamous cell carcinomas.

7. The growth inhibitory effect of TGF-β1 was reduced in 4 cell lines(YD-9, YD-10B, YD-17, YD-38) by MTT assay, when compared to that of normal oral mucosal cell.

From these results, the genetic mutations of TGF-β1 type II receptor gene were found in two cell lines and mRNA expression was slightly decreased. This study suggested that the altered regulation of TGF-β1 function might play a role in the development of OSCC.