Hepatitis B Virus X protein과 protein phosphatase Type 2C의 상호작용과 그 영향

Abstract

[한글]

Hepatitis B virus (HBV)의 감염은 급성 또는 만성 간염을 일으킴은 물론 간암 (hepatocellular carcinoma: HCC)을 발병시키는 중요한 인자로 인식되어 왔고 대부분의 HBV와 관련된 지난 20여년간의 연구들은 특히, HBV의 간암발생 기전을 밝힘에 있어서 HBV X protein (HBx)의 생물학적인 기능과 영향에 주목하게 되었다. HBx에 관한 초기의 연구들은 HBx가 다양한 viral 그리고 cellular promoter/enhancer elements를 transcriptional transactivation한다는 것을 밝혔다. HBx가 직접 DNA에 결합하지 않음에도 불구하고, AP-1, AP-2, NF- B, SRF, c/EBP, Ets, ATF1, Egr-1, CREB 등의 binding sites를 포함하는 광범위한 cis-elements들이 HBx에 의해 활성화된다는 것이 보고되었다. 이에 관련된 많은 연구들

은 이러한 HBx의 transcriptional transactivation의 기전을 세포질 내의 신호전달계를 활성화시킴으로써 이루어진다고 보고하였다. 그중에서도 특별히 AP-1, NF- B 같은 전사인자 활성화와 관계가 있는 Ras/Raf/ERK, MEKK-1/JNK, PI3K/Akt, Jak/STAT cascades를 활성화시키는 것에 관심을 가졌다. 이러한 HBx의 신호전달계 활성화는 DNA 손상복구, 세포주기조절 및 세포고사에 영향을 미칠 수 있음이 밝혀졌다. 따라서 HBx의 이러한 복합적인 활성은 간암 발생에 밀접하게 관계한다는 것을 시사하나, HBx가 세포내에서 직접 상호작

용하는 분자들에 대해서는 알려진 바가 거의 없다.

본 연구에서는 HBx가 세포내에서 직접 상호작용하는 분자들에 관심을 가지게 되었고, 그러한 분자에 대해 yeast two hybrid system을 이용한 실험에서 HBx가 protein phophatase type 2C (PP2C)와 결합한다는 정보를 얻게 되었다. Protein phosphatase는 크게 PTP, PP

P, PPM의 세 개의 family로 나눌 수 있다. 본 연구에서 관심을 갖는 PP2C는 PPM family에 속하는 주요 효소인데, 이러한 PP2C의 활성은 metal cation인 Mn2+나 Mg2+를 절대적으로 요구하지만, 다른 PPP family의 억제제나 okadaic acid에는 sensitive하지 않다고 알려져 있다. 지금까지 가장 잘 알려진 기능은 stress에 의해 활성화되는 JNK/p38 신호전달계나 Wnt 신호전달계 같은 protein kinase cascades에 관계하는 kinase의 활성을 reversing하여 inhibition하거나 activation하는 것이다. 덧붙여 몇몇 보고들에선 PP2C가 세포주기 조절에도 관여한다는 보고들이 이어지고 있다.

본 연구에서는 우선적으로 앞서 보고된 HBx와 PP2C의 직접적인 상호작용을 재확인하고, HBx와 PP2C의 결합이 PP2C의 활성에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. Co-immunoprecipitation assay를 통해 Chang 세포주와 Chang cell에 Tet-on system으로 HA tag이 붙은 HBx

가 유도발현되도록 만든 stable cell line인 Chang X 34 세포주를 사용하여 항 PP2C 항체로 면역침전을 시행한 다음, 항 HA 항체로 western blotting을 시행하여 세포내 발현되고 있는 PP2C와 doxycycline으로 유도 발현된 HBx가 결합하고 있음을 확인하였다. 또한 이러한 결합이 PP2C의 탈인산화 활성에 어떠한 영향을 미치는지를 알아보기 위해, 대장균에서 대량발현시켜 순수정제한 HBx와 PP2C의 재조합 단백질을 사용하여 pNPP을 기질로 하는 in vitro phosphatase assay를 시행하여 재조합 HBx가 재조합 PP2C의 탈인산화 활성에 저해효과를 나타냄을 확인하였다.

이러한 결과들을 바탕으로 HBx가 세포내에서 PP2C에 직접적으로 결합하고, PP2C의 탈인산화 활성을 저해함으로 인해 PP2C가 저해조절하고 있는 SAPK pathway나 CDKs등의 인산화와 활성을 유도하고 나아가 세포고사와 세포주기 조절에 영향을 미치게 될 것이라고 기대하게 되었다.

[영문]

Human hepatitis B virus (HBV) induces acute and chronic hepatitis, and is closely associated with the development of human liver cancer. Virally encoded X protein (HBx) has been thought to be a major risk factor for the development of human

hepatocellular carcinoma (HCC). In addition to stimulation of RNA polymerase, HBx also stimulates many type of transcription elements and factors. Transcription factors activated by HBx include AP-1, AP-2, NF- B, SRF, c/EBP, Ets, ATF1, Egr-1, CREB. Many of the reported activities of HBx have been shown to result from its ability to activate cytoplasmic signal transduction pathways, particularly the Ras-Raf-mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway, the cell stress-induced MEKK1-p38-c-Jun N-terminal kinase (SAPK) pathway. HBx has been reported to affect

DNA repair, cell cycle control, and apoptosis. Therefore, the pleiotropic activities of HBx are potentially relevant to the development of HCC.

This study has been focused on the molecules which interact with HBx in the cell, and the information that HBx can interact with protein phosphatase type 2 C (PP2C) was derived through yeast 2 hybrid system.

Protein phosphatase can be stucturally and functionally divided into three distinct families: PTP, PPP and PPM. PP2C relates to the main enzymes subtype of PPM, and the dephosphorylation activity of PP2C absolutely requires metal cation, Mn2+ or Mg2+, but its activity is not sensitive to the tumor promotor okadaic acid or other inhibitors of the PPP family. It is now well established that certain members of PP2C play a role in reversing protein kinase cascades activated by stress, JNK and p38 signaling pathway. PP2C and PP2C 2 dephosphorylate cyclin-dependent kinase (CDK), and positively regulate Wnt signal transduction and mediate their effects through the dephosphorylation of Axin. Recent research further revealed that PP2C may be involved in cell apoptosis, gene expression, and

other cellular function.

In this study, to confirm the preliminary information of the interaction of HBx and PP2C, Chang cell line and Chang X 34 cell line expressing HBx under the control of Tet-on system were used. Interaction of the endogenous PP2C with HBx in Chang X 34 cell line was observed by co-immunoprecipitation. Then, it was demonstrated that rHBx suppressed the dephosphorylation activity of rPP2C by in vitro phosphatase assays. Therefore, these results indicate that HBx interacts with PP2C and suppresses its phosphatase activity. Thus, it might be speculative that HBx induces the phosphorylation and activation of JNK, p38 and cdk2 associated apoptosis and cell cycle control through the suppression of PP2C activity.