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The effect of Na-K-Cl cotransporter inhibition on osteoclastogenesis induced by 1α,25-Dihydroxyvitamin D3

Other Titles
 Na-K-Cl cotransporter의 비활성화가 비타민 D3에 의해 유도되는 파골세포의 분화에 미치는 영향 
Authors
 김은영 
Issue Date
2002
Description
Dept. of Dentistry/박사
Abstract
[한글] Na-K-Cl cotransporter (NKCC1)은 다양한 세포와 조직에 분포하며 NKCC1의 기능은 세포 내외로 이온을 전달하고 세포의 부피와 이온의 균형을 이루고 또한 세포의 성장과 발육에 영향을 준다. 이 연구에서는 비타민 D_3에 의해 유도되는 파골세포에 NKCC1이 미치는 영향을 검토하였다. NKCC1의 선택적 억제제인 bumetanide를 10, 100 μM 첨가하였을 경우 TRAP 양성 세포의 수는 각 well당 평균 42에서 15로 감소하였다. Bumetanide 1 μM를 첨가하였을 경우 비타민 D3에 의해 유도되는 파골세포의 분화에는 영향을 주지 못하였다. 결과적으로 NKCC1의 억제로 인하여 파골세포의 분화가 억제된 것을 알 수 있다. Bumetanide의 억제 효과를 확인하기 위하여 RT-PCR을 통한 RANKL, OPG 그리고 M-CSF의 mRNA의 발현을 측정한 결과 조골세포에 대한 bumetanide의 농도가 높아질수록 RANKL과 M-CSF의 발현 정도는 감소하였고 RANKL의 decoy receptor인 OPG의 발현 정도는 증가하였다. 이러한 결과로 부터 조골세포에 bumetanide를 첨가하는 경우 조골세포내의 RANKL, OPG, M-CSF의 발현을 조절하여 파골세포로의 분화가 억제됨을 확인하였다. 또한 bumetanide를 첨가하여 NKCC1을 억제할 경우 원래 파골세포의 부피에 비하여 상대적인 파골세포의 부피가 36% 정도까지 감소하였으며, 이러한 변화의 기전을 밝히기 위하여 세포의 용적 변화의 매개 물질인 JNK를 검사한 결과 약물의 농도가 증가할수록 활성화된 JNK가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 결과적으로 NKCC1은 파골세포의 분화에 중요한 역할을 가지고 있으며, bumetanide에 의하여 억제된 NKCC1의 활성은 조골세포의 부피의 변화를 초래하고, 파골세포 분화 조절 인자인 RANKL, M-CSF의 감소 및 OPG의 증가를 유발한다.
[영문] Na/K/Cl cotransporters (NKCC1) have been reported in numerous, diverse tissues, and several cellular functions. NKCC1 is involved in ion transport across the secretory and absorptive epithelia, regulation of cell volume, and possibly modulation of cell growth and development. Furthermore, recent studies showed that NKCC1 is present in osteoblasts. In this study physiological role of NKCC1 in the process of osteoclastogenesis was exploited in coculture system. 10 and 100 μM bumetanide, a specific inhibitor of NKCC1, decreased the number of tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) positive multinucleated cells. One micromolar bumetanide did not show any effect on the 1α,25(OH)₂D₃-induced osteoclast differentiation. To clarify the role of bumetanide on the inhibition of osteoclastogenesis, mRNA expression of RANKL and OPG was analyzed by RT-PCR. Exposure of osteoblastic cell to the bumetanide treated medium resulted in the reduction of RANKL mRNA expression induced by 1α,25(OH)₂D₃, being dependent on the bumetanide concentration. On the other hand, the expression of OPG mRNA, a novel TNF receptor family member was increased. These results imply that 10 μM bumetanide inhibits osteoclast differentiation via inhibition of the RANKL mRNA expression and enhancement of the OPG mRNA expression in osteoblastic cell. However the expression of M-CSF mRNA which has been known to be a survival factor of osteoclasts was not changed at tested concentrations (1, 10, 100 μM). Also, we examined the expression and phosphorylation of c-Jun NH2-terminal kinase (JNK). The phosphorylation of JNK was reduced. Furthermore, bumetanide caused the decrease in the relative cell volume up to 36% of the original volume. Taken all together, these results suggest that NKCC1 in osteoblastic cell has an important role in the osteoclast differentiation and the inhibition of NKCC1 activity reduced the osteoblastic cell volume change, which in turn results in the inhibition of osteoclastogenesis, decreasing the phosphorylation of JNK.
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URI
https://ir.ymlib.yonsei.ac.kr/handle/22282913/127803
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