홍화씨 분획 추출물이 치주인대 섬유아세포와 MC3T3-E1 세포에 미치는 영향

Abstract

[한글]

최근 치주 영역에서 생약제제에 대한 관심이 증가되고 있으며 특히 홍화씨, 후박, 황금, 대조, 황백, 죽염, 황련, 은행엽, 옥수수 추출물 등이 치주염에 효과적인 생약제제로 알려져 있다.

이 중 홍화(safflower, Carthamus tinctorius L.)의 씨는 골절, 골다공증 등의 골질환 치료제로 쓰여 오면서 경험적으로 그 효능을 입증받은 제제로 수 년 전부터 치주 영역에서도 국내산 홍화씨에 대한 연구가 활발히 진행되어 홍화씨 추출물이 치주인대 섬유아세포와 조골세포의 활성도 증가, alkaline phosphatase(ALP) 활성도 증가, 골광물화 작용 증진에 효과적임이 보고되었으며 동물 실험에서도 홍화씨 추출물을 경구 투여했을 때 신생골 형성이 촉진됨을 보였다.

기존의 홍화씨 추출 방법은 한두 개의 용매를 이용하여 홍화씨의 전체 성분을 추출한 것이었으며 골조직 재생 효과를 극대화하기 위해서는 골조직 재생에 효과적인 성분만을 고농도로 추출하는 방법이 필요하였다. 이에 홍화씨 성분 중 골형성능 증진에 가장 효과적

인 성분을 찾기 위한 노력으로 다양한 용매를 이용하여 홍화씨 성분을 다단계 추출하여 여러 홍화씨 분획 추출물을 얻었으며 이 중 methanol과 물로 차례로 추출한 saf-M-W 분획이 조골세포의 골형성능 증진에 가장 효과적이었다.

이에 본 연구에서는 홍화씨 분획 추출물 saf-M-W를 이용하여 이것이 치주인대 섬유아세포와 조골세포 전구세포주인 MC3T3-E1 세포의 성장 및 분화에 미치는 영향을 알아보았다.

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) test로 두 가지 세포에 대한 독성을 측정하였으며 치주인대 섬유아세포에서 발색 반응을 이용한 ALP 활성도 검사를 시행하였다. 또한 MC3T3-E1 세포에서는 Northern blot 분석을 통해 ALP 및 bone sialoprotein (BSP) mRNA 발현을, von Kossa 염색과 위상차 현미경으로 석회화 결절 형성을 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. saf-M-W 농도 10㎍/㎖ 이하에서는 치주인대 섬유아세포와 MC3T3-E1 세포 모두에서 세포독성은 나타나지 않았다.

2. 치주인대 섬유아세포에서 saf-M-W 농도 변화에 따른 ALP 활성도 차이는 없었다.

3. MC3T3-E1 세포에서 10㎍/㎖ 농도의 saf-M-W 처리군의 ALP 및 BSP mRNA 발현이 대조군에 비해 현저히 증가하였다.

4. MC3T3-E1 세포에서 대조군에서는 석회화 결절이 형성되지 않은 반면 10㎍/㎖ 농도의 saf-M-W 처리군에서는 다량의 석회화 결절이 형성되었다.

이상의 결과는 홍화씨 분획 추출물 saf-M-W가 10㎍/㎖ 이하의 농도에서 치주인대 섬유아세포와 MC3T3-E1 세포에 대해 독성을 나타내지 않으며 MC3T3-E1 세포의 분화 및 골형성을 효과적으로 촉진할 수 있음을 시사한다.

[영문]

Recently, use of natural medicine is getting more attention, and some of them are believed to be effective in the treatment of periodontitis.

Among them, the seeds of safflower(Carthamus tinctorius L.) have been proven to be effective through its use in bone diseases such as fracture and osteoporosis.

During the last few years, studies using the seeds of safflower grown in Korea have been active, and it has been reported that safflower seed extract increase the proliferation and the alkaline phosphatase(ALP) activity of human periodontal ligament fibroblast(hPDLF), osteoblast, and that they promote the mineralization process. In animal studies, when safflower seed extract were administered orally new bone formation was promoted.

Recently, in an effort to find out the most effective osteogenic components, among many components of the safflower seed, various safflower seed fraction extracts were obtained by multistep extraction of the safflower components using various solvents. Among these, saf-M-W fraction extracted by methanol and water was most effective in increasing osteogenic potential of osteoblasts.

In this study, the effect of safflower seed fraction extract, saf-M-W, on the growth and differentiation of hPDLF and MC3T3-E1 cell was investigated. The toxicity of saf-M-W on both cells was measured using MTT test, and ALP activity was measured using the colorimetric assay of hPDLF. In addition, in MC3T3-E1 cells, the

expression of ALP, bone sialoprotein(BSP) mRNA was observed using Northern blot, and the mineralized nodule formation was observed using von Kossa stain and phase-contrast microscope.

1. In concentrations below 10㎍/㎖, saf-M-W didn't show any toxicity on hPDLF and MC3T3-E1 cell.

2. The change in saf-M-W concentration had no effect on the ALP activity of hPDLF.

3. In MC3T3-E1 cells, mRNA expressions of ALP and BSP were greater in the experimental group treated with 10㎍/㎖ concentration of saf-M-W compared with the control group.

4. In MC3T3-E1 cells, abundance of mineralized nodules were formed in the experimental group treated with 10㎍/㎖ concentration of saf-M-W, while no mineralized nodule was formed in the control group.

These results suggest that safflower seed fraction extract, saf-M-W, didn't show any toxicity on hPDLF and MC3T3-E1 cell at concentrations below 10㎍/㎖ and effectively enhanced the differentiation and osteogenic potential of MC3T3-E1 cell.