Cytokeratin 염색이 종양세포의 유세포분석에 미치는 영향

Abstract

[한글]

유세포분석기를 이용한 DNA 함량 분석에서의 합성기 분획(S-phase fraction; SPF)에 나타나는 증식지수는 세포독성 치료의 반응을 예측하는데 유용하나 DNA 단지표(single-parameter) 분석 합성기 분획이 종양에 있는 내피세포, 조직파편에 따라 영향을 받는 것으로

알려져 있다. 상피 세포는 cytokeratin(CK)을 표현하는데 cytokeratin 양성세포를 측정하면 비상피세포 오염을 감소시켜 상피세포 합성기를 더 정확하게 알 수 있다고 알려져 있다. 본 연구에서는 상피 종양세포의 단표지, cytokeratin 이중 표지에 의한 합성기 분획을 비교하고 cytokeratin 항체의 특성을 알아보며 cytokeratin 표지의 검체준비와 염색과정에서 변이계수의 변화를 줄 수 있는 요소를 알기 위해 몇 가지 방법을 비교하고 상피종양세포에 비상피세포의 혼합율에 따른 종양의 합성기 분획의 변화를 비교해 보고자 하였다.

Cytokeratin 양성이며 DNA 지수(DNA index)가 다르고 종양 발생부위가 서로 다른 HeLa, T24, KB, RPMI2650, MCF7 종양 세포와 특별한 질환이 없고 검사소견에서 이상이 없는 정상인 혈액의 정상대조군을 대상으로 하였고 HeLa, T24, KB, MCF7 종양 세포는 RPMI1640 배지(Lifetechnologies, Rockville, MD, U.S.A.)로 RPMI2650은 DMEM 배지(Lifetechnologies, Rockville, MD, U.S.A.)로 배양하고 건강인의 말초혈액에서 Ficoll Hypaque으로 단핵세포를 분리하여 메탄올을 섞은 후 -20 ℃ 10분간 고정하는 방법과 냉동 완충액을 사용하는 방법을 사용하여 두 방법을 비교하였고 1x10^6/㎖의 정상대조군과 종양 세포에 대해 동종형(isotype) 대조, cytokeratin 8/18(Becton Dickinson Immnocytometry Systems, San Jose, CA, U.S.A.), cytokeratin 7, 19(Dako Diagnostika, Glostrup, Denmark)를 염색하고 정상 대조군과 종양세포 혼합시 비율은 0:1, 1:4, 1:1, 4:1, 1:0으로 섞어 DNA 분석하고 합성기 분획을 계산한 결과는 다음과 같았다.

1. RPMI2650에서는 림프구가 첨가되면 Vindelov법의 합성기 분획은 CK 염색법에 비해 항상 낮았으며 림프구의 첨가 비율에 반비례적으로 감소되었다 (y=-6.12x+29.6).

2. RPMI2650, MCF7과 KB는 림프구의 첨가비율이 80%인 경우 Vindelov법의 합성기 분획은 CK 염색법에 비해 현저히 낮았다.

3. HeLa는 림프구의 첨가 비율이 50%일 때까지는 Vindelov법의 합성기 분획은 CK 염색법에 비해 항상 낮았으나 비율이 80%인 경우 CK 양성세포 gating시 양성 세포수가 적어 Vindelov법의 합성기 분획이 높게 나와 종양세포가 20에서 50%사이에서 분석 가능한 수준을 설정해야 할 것으로 생각되었다.

4. DNA 지수가 1.5이하인 RPMI2650과 HeLa는 세포수가 부족한 경우를 제외하고, DNA 지수가 1.75인 KB는 림프구가 50%인 경우를 제외하고는 CK 염색법 합성기 분획이 Vindelov법보다 높았고 DNA 지수가 1.86과 1.96인 T24와 MCF7에서 T24는 두 방법에서 합성기 분획이 유사하였으나 MCF7은 림프구가 증가함에 따라 Vindelov법의 합성기 분획이 더 낮아져 DNA 지수가 다른 종양에 따라 결과가 다름을 알 수 있었다.

5. CK8/18은 염색 강도가 우수하였으며(CK Y mean/Iso Y mean> 7.4) CK 19는 MCF7을 제외한 종양에서 염색 강도가 감소하여 낮은 해상도(CK Y mean/Iso Y mean < 4.9)를 보여줬고 냉동 완충액법에서는 염색되는 CK 양성 세포수 비율도 감소하여 MCF7을 제외한 종양에

서 합성기 분획 분석이 안되었다 (T24-6.4%, HeLa-1.1%, KB-1.4%, RPMI2650-6.7%).

6. CK19는 림프구를 섞지 않은 HeLa의 메탄올 고정법에서 양성 세포율이 11.1%일 때 50.7%의 합성기 분획을 보여 CK 양성 세포율이 11.1%이상이면 SPF의 분석이 가능함을 알 수 있었다.

결론적으로 cytokeratin을 이용한 이중 지표 DNA 분석의 합성기 분획 은 단지표 합성기 분획과 RPMI2650, HeLa, MCF7 종양세포에서 더 큰 차이를 보여 단지표 분석에서 비상피세포의 오염에 의한 합성기 분획 계산의 오류를 줄이고 예후를 더 잘 예측하기 위해 cytokeratin을 이용한 이중 지표 DNA 분석이 필요하며 본 연구의 세종류 CK 중 CK8/18이 가장 적합한 것으로 생각되었고 간단한 방법인 냉동 완충액법은 메탄올 고정법보다 염색 강도는 낮았으나 합성기 분획은 메탄올 고정법과 종양 세포에 따라 0.4-8.8% 차이를 보여 종양 검체의 종류에 따라 검사실에서 적용을 고려해 볼 수 있을 것으로 생각되었다.

[영문]

Though S-phase fraction(SPF) in DNA analysis has been used in predicting the response of treatment, it is well known that SPF of single parameter may be affected by stromal and also by inflammatory cells.

The epithelial cells express cytokeratin(CK) and it is known that cytokeratin measurement gives accurate SPF owing to reduce contamination of nonepithelial cells. In this study, the usefulness of cytokeratin dual staining was investigated to compare the results with the single parameter and SPF changes by mixed ratio of epithelial tumor cells and nonepithelial cells. Additionally, stain intensities of three cytokeratin antibodies, and also the difference of simplified freezing buffer method with the methanol fixation method were compared.

Cytokeratin positive HeLa, T24, KB, RPMI2650, MCF7 tumor cell lines which are different in DNA index and tumor occuring site and normal control lymphocytes were used. Tumor cells were cultured in RPMI1640 and DMEM medium and normal lymphocytes were separated by Ficoll Hypaque. Methanol fixation and freezing buffer method were compared and isotype control, cytokeratin 8/18(Becton Dickinson Immnocytometry Systems, San Jose, CA, U.S.A.) cytokertin 7, 19(Dako Diagnostika, Glostrup, Denmark) were stained and mixed ratio were 0:1, 1:4, 1:1, 4;1, 1:0 and SPF was analysed.

1. The single stained SPF was always lower than CK stained SPF by addition with lymphocytes and decreased in inverse proportion to addition of lymphocyte(y=-6.12x+29.6) in RPMI2650.

2. The single stained SPF was very lower than CK stained SPF by 80% addition of lymphocytes in RPMI2650, MCF7 and KB.

3 . The single stained SPF was lower than CK stained SPF by 50% addition of lymphocytes in HeLa but CK positive cells were few and single stained SPF was high in 80% addition of lymphocytes. The cut off level of analysis need to be established between 20% and 50% of tumor proportion.

4. The CK stained SPF was higher than the single stained SPF in RPMI2650 and HeLa except case of low cell count and in KB except lymphocyte 50 percent addition. The CK stained SPF was higher than the single stained SPF in MCF7 of DNA index 1.96 and

both stain result was similar in T24 tumor of DNA index 1.86. These mean that the results were different by DNA index of tumors.

5. The stain intensity of CK8/18 was good (CK Y mean/Iso Y mean> 7.4). The stain intensity of CK 19 was decreased in all tumors except MCF7, which mean decreased resolution(CK Y mean/Iso Y mean < 4.9) and SPF cannot be analysed in all tumors except MCF7 because CK positive cells rate were decreased in freezing buffer

method(T24-6.4%, HeLa-1.1%, KB-1.4%, RPMI 2650-6.7%).

6. The CK 19 stain without lymphocyte addition in HeLa methanol fixation showed 50.7% SPF when CK positive cells were 11.1%. This means that SPF analysis is possible when CK positive cells are above 11.1%.

In conclusion, there were some differences between the SPF of dual parameter DNA analysis using cytokeratin and single parameter SPF in RPMI2650, HeLa, MCF7.

Therefore, It would be advisable to use dual parameter DNA analysis using cytokeratin to decrease error in SPF by contamination of nonepithelial cells in single parameter analysis and predict more accurate prognosis. To get the highest intensity, CK 8/18 is suitable for dual staining and freezing buffer method may be preferable for simple use in laboratory according to type of tumor.