BOP(N-nitrosobis(2-oxopropyl)amine ) 유발 syrian golden hamster 췌장암 모델에서 farnesyltransferase inhibitor의 암 예방 효과

Abstract

[한글]

치사율이 높은 암으로 알려져 있는 췌장암의 90% 이상에서 K-ras 암유전자의 돌연변이가 동반되어 있는 데, K-ras 암유전자의 돌연변이는 발암 과정의 초기 단계에서 부터 관찰되고 암화 과정이 진행되면서 조직학적인 변화와 비례적으로 증가하여, 췌장암 발생에 핵심적인 역할을 할 것으로 생각되고 있다.

Ras 단백은 세포 밖의 신호에 의해 세포질 내의 GDP와 결합된 비활성화 형태에서 GTP와 결합된 활성화 형태로 바뀌어 Raf/MEK/MAP kinase의 일련의 신호전달체계를 활성화시켜 세포의 분화 및 증식에 관여 하게 된다. Ras 단백의 활성화 과정에는 farnesylation 이라

는 과정을 통한 세포막과의 연계가 필수적인데, 이 과정에 farnesyl transferase 라는 효소가 관여한다. Farnesyl transferase 의 작용을 억제하면 Ras 단백이 세포막에 부착되지못하여 활성화 형태를 이루지 못하게 되고, 따라서 Ras 이하 일련의 신호전달이 이루어 지지 않아 세포 증식 효과를 억제할 수 있을 것으로 생각되어 많은 연구가 진행되어 왔다그러나 지금까지의 연구들은 이미 형성된 암의 치료 효과 및 그 기전에 대한 연구였고, 암이 발생하기 이전의 화학 예방 (chemoprevention) 의 차원에서의 효과를 관찰한 연구는폐암·대장암·구강암 등에서 몇 예 시도되었을 뿐, 아직까지 췌장암에서 시도된 연구는 없었다.

본 연구에서는 사람의 췌장암과 유사한 조직학적 표현형을 보이는 N-nitrosobis (2-oxopropyl) amine (이하 BOP로 약함) 유도 Syrian golden hamster 췌장암 모델에 farnesyl transferase inhibitor (이하 FTI 로 약함) 를 암 발생단계 초기부터 투여하여, 투여하지 않은 군과의 단계별 조직학적 비교를 통하여 암 예방 효과 여부를 알아보고자 하였다.

양군 모두 BOP를 15㎎/㎏ 용량으로 매주 1회씩 피하 주사하여 12주간 투여하였으며, 실험군은 FTI 를 췌장 내 변화가 관찰되기 시작하는 실험 시작 9주부터 희생일 까지 매일 경구투여 하였고 대조군은 투여하지 않았다. 각각 16주 및 20주에 희생시킨 후 FTI 의 암예방 효과 여부를 관찰하였다.

16주째 대조군 모두에서 소엽 주위 (perilobular) 와 소엽 (lobular)내의 섬유화·신생 관 복합체 (tubular complex) 형성 및 소도세포(islet) 의 과증식이 관찰 되었고, 주 췌관 내에서는 50% 에서 유두상 증식 (papillary hyperplasia) 을, 나머지 50% 에서 이형성증식(dysplastic hyperplasia) 을 보였다. 신생 관 복합체는 대부분 단층배열을 하고 있었고 일부에서 유두상 증식을 보였으나 이형성 증식은 관찰되지 않았다. 이들 관 복합체는 기존의 췌관과는 구별되게 선방세포의 소실과 병행해서 선방세포가 위치해야 할 소엽의 말초에서 관찰되었는데 이는 선방세포로부터 췌관 세포로의 이행분화(transdifferentiation) 에 기인한 결과로 생각되었다. 20주째에는 87.5% 에서 육안상 5-10mm 크기의 단단하고 고정되어 있는 결절이 관찰되었고 췌장은 심하게 위축되어 있었다. 결절은 ductal a denocarcinoma 형태를 보이고 있었는데, 이는 췌관 세포들로 치환된 것으로 고려되는 말초 선방세포 위치에 존재하고 있었다. 악성화된 결절부위는 주 췌관과는 구분되어 있었는데, 오히려 주 췌관 내에서는 16주째 와 유사하게 유두상 증식 및 이형성 증식이 관찰되었으나 악성화된 증거는 없었다.

16주째 실험군에서도 모두에서 소엽 주위와 소엽 내 섬유화·신생 관 복합체의 형성 및 소도세포의 과증식을 관찰할 수 있었으나 그 정도가 대조 군과 비교해 볼 때 경미하였고,관 복합체는 거의 모두 단층 배열을 하고 있었다. 반면 주 췌관은 대조군과 유사한 정도의 유두상 증식 및 이형성 증식이 관찰되었다. 20주째의 변화는 BOP군과는 확연한 차이를보여 말초 소엽에서의 선암 발생은 전 예에서 없었다. 신생 관 복합체는 일부에서만 특정소엽에 국한되어 형성되었을 뿐, 췌장의 대부분은 정상적인 선방세포 구조를 유지하고 있었다. 반면 주 췌관은 대조군과 유사하게 유두상 증식 및 이형성 변화가 관찰되었다.

이상의 결과로 FTI 는 BOP 유발 hamster 췌장암 모델에서 Ras 단백의 활성화 억제를 통하여 암 발생을 초기 단계부터 효과적으로 억제하여 암 예방효과가 있음을 보여주는 것으로, 향후 이의 임상적 활용이 크게 기대된다 (대조군 암 발생률 87.5%, 실험군 0%). 또한흥미로운 점은, 선방세포로부터 이행되었을 것으로 생각되는 신생 관 복합체의 생성 및 악성으로의 변화가 대조군에 비하여 실험군에서 현저히 억제되었으나, 주췌관의 이형성 증식에는 두 군간의 차이가 없었다는 점이다. 이는 ras 암 유전자의 돌연변이가 90% 이상에서 관찰되는 인체 췌장암의 발생 기원세포가 췌관세포 자체라기 보다는 선방세포로부터이행 분화된 새롭게 형성된 관 복합체에 존재하는 세포일 가능성과 함께, 선방세포에서 췌관 세포로의 이행 및 암화 과정에 Ras 단백이 중요한 역할을 할 것임을 의미하며, BOP에 의한 주 췌관 세포의 증식은 Ras 단백이 아닌 새로운 관련인자가 존재할 것임을 시사한다. 아울러 이들 조직에서의 다양한 암 관련 유전자 변이 규명을 통해 K-ras 암 유전자 외에 췌장암 발생의 초기 관련 인자를 규명하기 위한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다

[영문]

Background: Pancreatic ductal adenocarcinoma is a highly lethal malignancy and resistant to traditional cytotoxic therapy. K-ras oncogene mutation has been shown to be frequent event in this. Ras protein serves as connector between signals generated at plasma membrane and nuclear effectors. Early stage disruption of Ras signaling pathway can have significant potency as a chemopreventive strategy. The activation of Ras protein depends upon its posttranslational farnesylation. High rates of active K-ras oncogene mutations in pancreatic ductal adenocarcinoma have

generated considerable interest in the therapeutic application of novel farnesyltransferase inhibitors (FTIs).

In in vitro experiments and transgenic mouse models, FTIs has been proved to suppress of growth of pancreatic cancer cells and induce apoptosis. But, the mechanism has been unknown yet. Mutation of K-ras oncogene is early event in the carcinogenesis of pancreatic cancer, so the use of FTIs at early stage for chemopreventive effect on pre-cancerous condition ( eg. chronic pancreatitis ) is considerable interest. But, a comprehensive analysis of the chemopreventive effect of FTIs on pancreatic cancer cells has not been performed. So we conducted the

experiment to determine chemopreventive effect of FTIs at pre-cancerous stage of pancreatic cancer, which induced by N-nitrosobis (2-oxopropyl) amine (BOP) in hamsters

Method: We used 32 female Syrian Golden Hamsters, which were divided into two groups. In one group, we administrated BOP (15㎎/㎏) subcutaneously once a week for 12 weeks and FTIs (50㎎/㎏) orally daily from 9 weeks to terminal day. In the other

group, only BOP was administrated. We sacrified them at 16 weeks and 20 weeks after BOP injection.

Redult: At 16 weeks, in all control cases perilobular and lobular fibrosis, neo-tubular complex formation, and islet cell hyperplasia were observed, and in main duct, papillary hyperplasia occurred in half of cases and dysplastic hyperplsia in other half of cases. Most of neo-tubular complex had single layer, and in some cases papillary hyperplasia was seen, but not dysplastic hyperplasia. Unlike usual pancreatic duct, these tubular complex was associated with loss of acinar cells and located at periphery of lobule.

At 20 weeks, in 87.5% of cases, grossly 5-10 mm sized, hard, and fixed nodules were observed, remnant pancreas was atrophied. These nodules had the morphology of ductal adenocarcinoma, and located at periphery of lobule where acinar cells previously had been. These malignant nodules were separated from main pancreatic

duct, and in main pancreatic duct, papillary hyperplasia and dysplasic hyperplasia were observed, but no evidence of malignant transformation was seen.

At 16 weeks, in experimental cases, like control cases, perilobular and lobular fibrosis, neo-tubular complex formation, and islet cell hyperplasia were observed, but the degree was less severe. Most of neo-tubular complex had single layer. However, in main pancreatic duct, there was no difference of papillary hyperplasia and dysplastic hyperplasia between experimental cases and control cases.

Changes at 20 weeks were quite different from control group that no adenocarcinoma was found at peripheral lobule. Neo-tubular complex were formed at focal lobules in some cases, and most of pancreas maintained their acinar structures. Although, at

main pancreatic duct, papillary hyperplasia and dysplastic hyperplasia were still persisted like control cases.

Discussion: Interestingly, neo-tubular complex formation and malignant transformation from acinar cell were significantly inhibited in experimental cases, but changes at main pancreatic duct were not different between two groups. Possible explanation is that stem cells of human pancreas cancer, which were associated with ras oncogene mutation in 90% of cases, might be existed at neo-tubular complex originated from acinar cells, and hyperplasia of main pancreatic duct might be associated with factors other than ras oncogene.

Above results suggested FTI possessed chemopreventive effect for BOP-induced pancreas cancer in hamster by inhibiting activation of Ras protein in condition that pancreatic main duct would not change into malignancy. Further studies regarding its clinical application are expected.