누에 분변으로부터 추출한 포르피린 유사체의 광활성에 의한 수포성 구내염 바이러스의 불활성화

Abstract

[한글]누에 분변에서 추출된 포르피린 유사체(CpD)는 "광역동성 치료(Photodynamic therapy; PDT)"라 불리는 종양의 광화학 치료를 위한 광활성인자(photosensitizer)로 개발되었으며, 항레트로바이러스 제제의 역할을 할 수 있다고 보고되었다. 광역동성 치료와 같이 광역동성 항미생물 화학치료(photodynamic antimicrobial chemotherapy)는 광활성인자와 빛에 의해서 미생물에 산화적 손상을 주며, 특히 바이러스에 감염된 혈액산물들의 소독에 이용되고 있다. 광역동성 항미생물 화학치료는 in vitro에서 세균, 효모, 바이러스, 기생충을 억제하는 데 효과적인 것으로 알려져 있으나, 광역동성 치료만큼 널리 사용되고 있지 않다.

광활성인자의 광활성에 의한 지질막을 가진 바이러스들의 불활성화에 관한 기전은 완전하게 알려지지 않았다. 따라서 지질막을 가지고 있는 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus; VSV)를 CpD에 의한 광역동성 작용의 주요한 표적을 찾기 위한 모델로 사용하여, CpD의 항바이러스 효과를 확인하고, CpD에 의한 수포성 구내염 바이러스 광불활성화의 주요한 표적을 확인해보고자 하였다.

CpD에 의해 유도되어지는 VSV의 광불활성화에 대한 효과를 플라크 형성 측정법(plaque forming assay)을 사용하여 확인하였다. CpD는 농도에 비례하여 최대 7log까지 VSV를 불활성화시켜, 광활성화된 CpD 농도 15∼60 ㎍/ml에서는 플라크가 형성되지 않았다. 세포내 바이러스 RNA를 RT-PCR을 통하여 확인하였고, 세포내 바이러스 RNA 합성능을 3H-urindine 흡착을 통하여 측정한 바, 광활성화된 CpD 30 ㎍/ml에서 세포내 바이러스 RNA가 검출되지 않았으며, 광활성화된 CpD 농도에 비례하여 바이러스 RNA 합성능이 감소되었다. CpD의 광역동성 작용에 의한 바이러스 단백질의 손상을 전기영동을 통하여 확인한 결과, M 단백질의 손상이 확인되었고, 젤 상단에 소실된 바이러스 단백질에 의한 밴드(cross-links)가 생성되었다. 또한 CpD와 빛을 처리한 후의 바이러스 RNA 중합 억제는 in vitro 전사 측정법을 이용하여 확인하였는데, 광활성화된 CpD 농도에 따라서 바이러스 RNA 전사가 감소되었다.

이러한 결과들로써 광활성화된 CpD는 VSV와 같은 지질막을 가진 바이러스를 불활성화시켜, 항바이러스 제제로서의 효과를 가지고 있으며, CpD에 의한 VSV 광불활성의 주요한 표적이 M 단백질과 바이러스 RNA나 바이러스 RNA 중합효소 또는 그 복합체임을 시사한다.

[영문]Efficacy of porphyrin derivatives from silkworm excreta(CpD) in photodynamic antimicrobial chemotherapy(PACT) was examined. Vesicular Stomatitis Virus(VSV), a lipid-enveloped virus, was used as a model virus to explore the primary targets for the photoinactivation by CpD with light(CpD-PACT). CpD was developed as a photosensitizer in photochemotherapy of cancer called "photodynamic therapy(PDT)" and a putative antiviral effect of CpD on Gross leukemia virus was also demonstrated in experimental CpD-PACT. PACT is widely used in disinfections of blood products, particularly for virus contamination. Like PDT, PACT also utilizes photosensitizers and visible or ultraviolet light in order to give oxidative damage to microbes. The antiviral effect of CpD-PACT on VSV is not studied. Thus, a study was designed to clarify the primary target for the photoinactivation by CpD on VSV.

The effects of CpD-PACT on VSV were scored by use of the plaque forming unit(PFU) assays. Reduction in PFU by CpD inactivated VSV was exhibited in a dose-dependent manner. Complete loss of infectivity of the virus was scored when the virus was treated with a dose of 15∼60 ㎍/ml of CpD. Synthesis of the viral RNA in host cells was comparatively assayed in assays of RT-PCR. The viral RNA was undetectable at a dose of 30 ㎍/ml CpD following the light irradiation. As expected, reduced viral RNA synthesis in the host cells determined by the incorporation of 3H-uridine was correlated with the loss of infectivity in PFU assays. Direct effect of CpD-PACT on the level of M protein and the rate of RNA transcription of the VSV was examined to determine the immediate target molecules affected by the treatment. Gel electrophoresis for the level of M protein and an in vitro transcription assay employing 3H-UTP for RNA transcription were employed. The results revealed an immediate decrease in M protein levels and a gradual decrease in RNA transcription in a dose-dependent manner following CpD-PACT. These results indicated that both of the M protein and the transcription machineries of the virus served as the target molecules for CpD-PACT.

As results, CpD is demonstrated to be a potential anti-VSV agent by damaging the matrix protein as well as transcription machineries involved. At present, differential effect of CpD-PACT on M protein, RNA, and RNA polymerase are not demonstrated.