Acetyl CoA carboxylase의 순수분리와 trypsin처리에 의한 활성도 변화

Abstract

[한글]

Acetyl CoA carboxylase는 생체 내에서 단기적으로는 cirtrate 및 isocitrate에 의해서 활성화되면 장기적으로는 nutritional 또는 hormonal state에 따라서 조절된다고 보고되어 있다.

그러나 생체 외에서는 cirtrate나 isocitrate에 의해서 뿐만 아니라 tryspin처리시 또는 오랜 시간 동안의 냉장고 내 보관시에도 그 활성도가 증가한다는 사실도 보고되어 있으나 그 기전은 아직 잘 밝혀져 있지 않다.

본 연구는 trypsin처리시 또는 오랫동안 냉장고 보관시에 이 효소활성이 증가하는 사실을 구명하기 위하여 장시간 굶긴 백서에 무지방 고함수탄소식이를 재투여하여 이 백서 간장세포로부터 polyethylene glycol, ammonium sulfate, Sepharose 2B gel filtration, DEAE-Sephacel column chromatography를 이용하여 actyl CoA carboxylase를 분리 정제하여 이 효소 활성도와 이때 이 효소를 구성하는 소단위 단백질의 분자량과의 상호관계를 밝히고 부분정제된 acetyl CoA carboxylase에 trypsin을 처리하여 이 효소의 활성도변화를 비교 관찰하였다.

백서을 3일간 굶긴 다음 고함수탄소 식이를 3일간 재투여한 후 간장세포에서 acetyl CoA carboxylase를 polyethylene glycol 및 ammonium sulfate를 처리한 후 Sepharose 2B gel filtration을 시행하여 1,522배 분리 정제 하였으며 이 효소의 specific activity는 단백질 mg당 3.88units이었다.

이때 SDS-PAGE를 시행하여 분자량 220,000 및 120,000에 해당하는 주된 단백질대를 확인하였다. 이 효소용액을 DEAE-Sephacel column chromatography를 시행하였던 바 약 12,000배 분리 정제하였으며 이 효소의 specific activity는 단백질 mg 당 30 units이었다.

이때 SDS-PAGE를 시행하여 분석해 본 결과 Sepharose 2B gel filtration 시행 후 SDS-PAGE 상에서 나타났던 분자량 220,000에 해당하는 단백질대가 소실되면서 분자량 120,000 및 110,000에 해당하는 단백질대가 나타났는데 이는 분리 과정 중 proteolytic enzyme에 의하여 가수분해된 결과로 사료되며 이때 효소 활성도가 7.55배 증가되었다.

Sepharose 2B gel filtration 시행 후 얻은 효소를 토끼에 주사하여 얻은 항 혈청과 간장세포 균등액을 20,000xg로 원침하여 얻은 상층액의 3% polyethylene glycol 추출액과 작용시켜 Ouchterlony double immunodiffusion 실험을 한 결과 항 혈청 15μl는 간장세포 균등액과 반응하여 서로 연결된 하내의 침전대가 형성되었으며, 이 항 혈청을 가지고 protein A Sepharose column chromatography를 시행하여 얻은 IgG 농도를 증가시켜 첨가하면 acetyl CoA carboxylase 활성은 IgG 농도에 비례하여 억제된 사실로 미루어 가토 혈청에서 분리한 IgG에는 acetyl CoA carboxylase에 대한 항체가 생성되었음을 재 확인하였다.

부분정제된 acetyl CoA carboxylase 효소 용액에 trypsin을 단백질 mg당 0.625, 1.25, 1.875μg씩 가하여 1분 동안 반응시킨 후의 각 효소 활성도는 각각 375%, 382%, 173%로 증가하였으나 trypsin 농도가 증가함에 따라 효소활성은 0.625μg시에 비하여 75.2%, 46.1%를 나타내었다.

또한 trypsin을 일정량(1.5μg) 가한 뒤 반응시간을 증가시킴에 따라 그 활성도가 1분에서 2분까지는 250%, 194%로 증가하나 5분, 10분 후에는 92%, 34%로 점차 감소하였다.

이런 결과는 trypsin에 의해 이 효소 단백질이 분자량 110,000 또는 120,000 이하로 절단되면 효소활성이 소실되는 사실을 시사하며 이 사실은 SDS-PAGE상에 나타난 결과와 일치한다.

[영문]

On the contrary to the report that acetyl CoA carboxylase is a single polypetide of MW 220,000-260,000 that contains 2-6 moles of phosphate and 1 mole of biotin, the enzyme has been suggested to have a MWs of 220,000-260,000 composed of 2 subunits with MWs of 220,000 and 108,000. It has been known that acetyl CoA carboxylase activity is stimulated by citrate or isocitrate temporarily and also regulated by nutritional and hormonal state for a long term in vivo. It has been reported that acetyl CoA carboxylase activity was stimulated by trypsin treatment or by the prolonged storage in the refrigerator as well ascitrate or isocitrate in vitro. In the present study, acetyl CoA carboxylase was purified from the liver of rats refed with a fat free high cabohydrate diet after the 3 days fasting, through polyethylene glycol, ammonium sulfate precipitation, Sepharose 2B gel filtration and DEAE-Sphacel column chromatorgraphy, and the MWs of subunits and the change in the enzyme activity were measured. Acetyl CoA carboxylase purified 1,522 folds from the liver of rats fasted for 3 days then by refed with a fat free high carbohydrate diet and had a specific activity of 3.88 Units/mg protein. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of this enzyme showed two protein bands corresponding MWs of 220,000 and 120,000. Specific activity of acetyl CoA carboxylase obtained after the DEAE-Sephacel column chromatography was 30 Units/mg protein and the enzyme was purified 12,000 folds. Upon SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, only two protein bands corresponding MWs of 120,000 and 110,000 were appeared with the

disappearance of a protein band having MWs of 220,000, indicating that proteolytic hydrolysis of the enzyme into two subunits during purification. The reason for the dramatic increase of the enzyme activity by proteolysis is not known. Ouchterlony

double immunodiffusion between rabbit antiserum against acetyl CoA carboxylase prepared through Sepharose 2B gel filtration step and 3% polyethylene glycol extract of the 20,000xg supernatant of liver homogenate was carried out. 15ml of antiserum cross-reacted with liver homogenate and formed a sharp hexagonal precipitin. Addition of IgG prepared from the antiserum by protein A Sepharose column chromatography to the 5% polyethylene glycol precipitate of liver homogenate inhibited the actyl CoA carboxylase activity in parallal to the IgG concentration indicating the presence of antibody against acetyl CoA carboxylase in the IgG. Treatment of 0.625, 1.25, 1.875 mg of trypsin to 1 mg of partially purified actyl CoA carboxylase resulted in the increase of the enzyme activity in the order of

375, 282, 178%, respectively. The inhibition of acetyl CoA carboxylase by trypsin(1.5μg/mg protein) was dependent on the incubation time indicating that the extensive hydrolysis of the enzyme by trypsin decreased the enzyme activity.