흰쥐 췌장 선세포의 cholecystokinin A 수용체에 대한 rebamipide의 작용

Abstract

[한글]

Rebamipide는 위궤양치료제로 사용되는 약물로서 이의 유리산소 생성억제 및 항산화 효과가 위점막을 보호하는 기전으로 알려져 있다. 예비실험에서 rebamipide가 췌장 선세포에서 [Ca**2+ ]^^i oscillations을 야기하는 것을 관찰한 결과를 토대로 본 실험에서는 rebamipide의 세포내 칼슘 증가 기전을 밝히고자 하였다. 흰쥐를 단두하여 희생시킨 후 즉시 췌장을 적출하고 얼음 위에서 지방조직을 제거한 후 collagenase를 이용하여 적출한 췌장 선세포를 분리하였다. 세포 내 칼슘농도는 칼슘에 민감하게 반응하는 fura-2를 이용하여 spectrofluorometer로 측정하였다. 수용체 결합은 [(3)**H]-CCK-8S을 사용하여 rebamipide의 췌장 선세포에 대한 [(3)**H]-CCK-8S 결합억제로 확인하였다. Amylase는 Bernfeld 법을 사용하여 측정하였으며 amylase 유리는 췌장 선세포 내 총 amylase양 중 유리된 양의 비를 백분율로 나타내었다. Rebamipide는 췌장 선세포에서 [Ca**2+ ]^^i oscillations을 일으켰다. Rebamipide는 5 -1000 μM 농도에서 농도 의존적으로 [Ca**2+ ]^^i Oscillations 빈도를 증가시켰으며 약물투여 후 반응이 나타나는 latency는 감소시켰다. Rebamipide에 의한 [Ca**2+ ]^^i oscillations은 CCK-A 수용체 길항제인 L-364,718에 의해서 억제되었으나 CCK-B 수용체 길항제, L-365,260, acetylcholine 수용체 길항제인 atropine에 의해서는 아무런 영향을 받지 않았다. Rebamipide에 의한 췌장 선세포로부터 amylase 유리는 최고 효능 농도에서 CCK-8에 의한 amylase 유리보다 적었다. CCK-8에 의한 amylase 유리는 100, 1000 μM rebamipide에 의해서 농도 의존적으로 억제되었으며 이는 rebamipide가 CCK-8의 결합을 억제하여 나타나는 것으로 생각된다. 실제로 rebamipide는 [(3)**H]-

CCK-8S의 흰쥐 췌장 선세포 CCK-A 수용체에 대한 결합을 농도 의존적으로 억제하였는데 수용체 결합분석 결과 IC^^50은 104 μM이었으며 이 값은 CCK-8S의 36 nM보다 매우 낮았다. 또한 CCK-8S은 K^^d가 12.4 nM과 20 μM인 두 개의 결합부위를 가지는 반면 rebamipide는 K^^d 가 98.5 μM인 결합부위 하나만을 보였다. 이상의 실험결과들을 정리하면 rebamipide는 췌장 선세포에서 CCK-A 수용체에 결합하여 [Ca**2+ ]^^i oscillations을 일으키며 amylase 유리시키나, CCK-8과 비교하여 그 효능은 매우 낮은 부분효현제로 생각된다.

[영문]

The protective effect of rebamipide on gastric mucosa is well established. Here we demonstrated that rebamipide acts on pancreatic acinar cells to generate oscillations of intracelluar Ca**2+ concentration ([Ca**2+ ]^^i ) through activation of cholecystokinin-A (CCK-A) receptors. Male Sprague-Dawley rats were killed by decapitation and the pancreata were immediately removed and trimmed of fat on ice. Isolated acini were prepared by enzymatic digestion. [Ca**2+ ]^^i was determined by monitoring changes in the fluorescence of the Ca**2+ -sensitive indicator, fura-2, in individual acinar cells. Amylase activity was measured using Bernfeld method and amylase release was calculated as the percentage of the total amylase content of the acini. Competition experiments with [(3)**H]-CCK-8S were used for determination of the affinity of rebamipide for CCK-A receptor.

At concentrations higher than 5 μM, rebamipide induced [Ca**2+ ]^^i oscillations in individual fura-2 loaded pancreatic acinar cells. The frequency of oscillations was increased with increasing concentrations of rebamipide, while the latency between stimulation of cells and initiation of [Ca**2+ ]^^i decreased with increasing concentrations. The [Ca**2+ ]^^i oscillations evoked by rebamipide were inhibited by the CCK-A receptor antagonist, L-364,718 but not by atropine or the CCK-B receptor antagonist, L-365,260. In dispersed acini from rat pancreas, the stimulation of amylase secretion caused by a maximally effective concentration of rebamipide was much less than that caused by a maximally effective concentration of CCK-8S. Rebamipide at the concentration of 100, 1000 μM caused a

concentration-dependent inhibition of amylase secretion by CCK-8S. Rebamipide inhibited in a concentration-dependent manner the binding of [(3)**H]-CCK-8S to CCK-A receptors on rat pancreatic acini with an IC^^50 value of 104 μM, which was much less than that of CCK-8S (36 nM). These results indicate that, in rat

pancretic acini, rebamipide is a partial agonist and that this partial agonist activity is produced by occupation of the CCK-A receptors by rebamipide.