가토 경동맥 외번모델에서 발생하는 혈전에 대한 신규 혈소판 길항제(살모신)의 효과

Abstract

[한글]

혈소판의 glycoprotein(GP) Ⅱb/Ⅲa 수용체는 혈소판 응집의 최종단계에 관여하는 필수적인 세포 점착분자로서 혈소판에만 존재한다. 혈관손상에 의해 혈소판이 활성화 되면, GP Ⅱb/Ⅲa 수용체가 구조변화를 일으켜 다양한 기질, 특히 fibrinogen의 RGD(Arg-Gly-Asp) 서열과 결합하여 혈소판의 응집을 유발하게 된다. 따라서 GP Ⅱb/Ⅲa 수용체 길항제의 사용은 혈전형성 방지에 좋은 효과를 줄 것으로 기대된다.

이에 본 연구자는 한국산 살모사(Agkistrodon halys brevicaudus)의 독에서 새롭게 분리한 GP Ⅱb/Ⅲa 수용체 길항제인 salmosin이 생체 외에서 여러 종류의 세포외 기질단백질에 대한 혈소판의 점착에 어떠한 영향을 주는지 확인하고, 이를 근거로 가토 경동맥을 외번시켜 만든 혈전모델에서 salmosin의 항혈전 효과를 알아보고자 하였다.

본 연구에서 혈소판 점착 및 침착 정도를 용이하게 정량적으로 분석하기 위하여 사람의 혈소판 농축액을 이용하여 (111)**Indium((111)**In) 표지 혈소판을 제조하였고, 실험에 필요한 다량의 salmosin을 얻기 위하여 유전자재조합 대장균을 사용하였다. 생체 외에서 salmosin의 혈소판 점착 억제능력을 알아보기 위해 4 종류의 세포외 기질단백질(fibronectin, vitronectin, collagen, laminin)과 GP Ⅱb/Ⅲa 수용체의 강력한 기질로 알려진 fibrinogen을 96-well plate에 도포한 후, (111)**In 표지 혈소판에 1 μM의 salmosin을 전처리하고 세포외 기질단백질 및 fibrinogen을 도포한 96-well plate에 반응시켜 혈소판 점착 억제정도를 비교하였다.

혈소판 침착 억제효과를 평가하기 위하여 가토의 총경동맥을 적출한 후 외번시키고 미리 제작한 관류계내의 도자 양쪽에 연결한 혈관 외번모델을 이용하였다. 대조군으로는 약제를 처리하지 않은 (111)**In 표지 혈소판 용액만을 관류시켰고, 시험군으로 여러 농도

의 salmosin(30μg/ml, 45 μg/ml,60μg/ml,90μg/ml)을 처리한 (111)**In 표지 혈소판 용액을 관류시켰다. 비교군으로는 여러 농도의 abciximab(60 μg/ml, 90 μg/m1, 120 μg/ml, 200 μg/ml)을 처리한 (111)**In 표지 혈소판 용액을 관류시켰다. 관류 후 혈관절편에 침착된 혈소판 수를 방사성 동위원소 측정기로 측정하였다.

1. 생체 외에서 salmosin(1 μM)의 혈소판 점착 억제효과를 조사한 결과, 세포외 기질단백질인 fibronectin, vitronectin과 fibrinogen에 대한 혈소판 점착이 collagen과 laminin에서보다 통계적으로 유의하게 감소됨을 알 수 있었다.

2. Ex vivo로 수행한 혈관 외번모델에서 (111)**In 표지 혈소판 용액만을 관류시킨 대조군(n=8)에서 침착된 혈소판 수는 9.8±2.5× 10**8/cm**2 이었고 혈소판 침착율은 23.9 ± 7.0%이었다.

3. 여러 농도의 salmosin을 전처리한 시험군에서 (111)**In 표지 혈소판의 침착은 용량 의존적으로 억제 되었다.

4. 여러 농도의 abciximab과 전처리한 비교군에서도 (111)**In 표지 혈소판의 침착은 용량 의존적으로 억제되었다.

5. 본 실험에서 사용한 혈전모델에서, salmosin의 IC**50값(50%의 혈소판 침착 억제농도)은 43 μg/ml이었으며, abciximab의 IC**50값은 158 μg/ml이었다. 또한, IC**50를 상회하는 농도의 salmosin(60 μg/m1)과 abciximab(200 μg/ml) 처리군(각각 n=5)에서 혈소판 침착은 통계적으로 유의하게 대조군보다 억제되었다.

이상의 결과로 새로운 혈소판 길항제인 유전자재조합 salmosin이 생체 외 실험에서 fibrinogen을 매개로 한 혈소판 점착뿐만 아니라 세포외 기질단백질에 대한 혈소판의 점착에도 억제효과를 나타낸다는 사실을 새롭게 규명하였으며, 외번모델을 이용한 ex vivo 실험에서는 현재 임상에서 사용 중인 abciximab보다 약 1/3의 낮은 농도에서 동일한 혈소판 침착 억제효과를 보인다는 사실을 확인하였다. 향후 새로운 항혈전제로서의 활용 가능성을 알아보기 위하여 더 많은 기초 및 임상연구가 진행되어야 할 것으로 생각된다.

[영문]

The integrin, glycoprotein Ⅱb/Ⅲa(GP Ⅱb/Ⅲa) receptor is considered to be the final common pathway of platelet aggregation and unique to platelets. When platelets are activated, the receptor undergoes a conformational change and binds the RGD(Arg-Gly-Asp) sequence of various ligands. Finally, platelet aggregation occurs through binding of fibrinogen which is one of these ligands as a bridge.

Therefore, a powerful GP Ⅱb/Ⅲa receptor antagonist is expected to effectively prevent thrombus formation

The purpose of this study was to determine whether a new platelet GP Ⅱb/Ⅲa antagonist, salmosin, which was purified from Agkistrodon halys brevicaudus(Korean salmosa) snake venom had inhibitory effect on platelet adhesion to the various extracellular matrix(ECM) proteins and on platelet deposition in rabbit carotid artery eversion model.

In this study, recombinant salmosin which is produced from recombinant E. coli was used. Ninety six-well plate was coated with four ECM proteins such as fibronectin, vitronectin, collagen. laminin and fibrinogen, which is a strong ligand of GP Ⅱb/Ⅲa receptor. Salmosin of 1 μM and (111)**In-labeled platelets were placed concomitantly on ECM proteins-coated plate.

The carotid arteries of New Zealand white adult rabbits of either sex were used in arterial eversion model. The vessel segments were perfused in the perfusion chamber. In control group, only (111)**In-labeled platelets were perfused, and mixed solutions of salmosin(30 μg/ml, 45 μg/ml, 60μg/ml, 90 μg/ml) and (111)**In-labeled platelets were perfused in salmosin administration group, and mixed solutions of abciximab(60 μg/ml, 90 μg/ml, 120 μg/ml, 200 μg/ml) and (111)**In-labeled platelets were perfused in abciximab administration group.

We compared the inhibitory effect on platelet deposition in the salmosin-perfused group, abciximab-perfused group, and control group by measuring the radioactivity of deposited (111)**In-labeled platelets.

The results were as follows:

1. There was a significant inhibition of platelet adhesion on fibronectin, vitronectin and fibrinogen by salmos in of 1 μM compared to that of the control group(p<0.05).

2. The deposited platelets in control group(n=8) were 9.8 ± 2.5 × 10**8 and the deposition rate was 23.9± 7.0%.

3. The platelet deposition was dose-dependently inhibited by salmosin as well as by abciximab in the rabbit carotid artery eversion model.

4. The salmosin had an IC**50 of 43 μg/ml and abciximab had an IC**50 of 158 μg/ml in the rabbit carotid artery eversion model. A significant decrease in platelet deposition by salmosin(60 μg/ml, n=5) and abciximab(200 μg/ml, n=5) was seen compared to that of the control group.

In conclusion, these results show that recombinant salmosin inhibits effectively platelet adhesion to fibronectin, vitronectin and fibrinogen and platelet deposition in the rabbit carotid artery eversion model as well. However, it is considered that further in vivo studies are necessary to use salmosin as a

antithrombotic agent in the future.