흰쥐 악하선 세포에서 gap junction 봉쇄제인 octanol이 타액분비 및 세포내 Ca2+ 농도 조절에 미치는 영향

Abstract

[한글]

세포내 유리칼슘 (free calcium, Ca**2+)은 세균에서 고등동물에 이르기까지 거의 모든 세포에서 세포고유작용을 조절하는 중요한 세포내 신호전달체계 (signal transduction system)의 매개체이다. 타액선 세포에서 부교감신경 자극으로 타액분비가 증가될 때에도 세포내 Ca**2+ 농도 증가가 가장 중요한 역할을 한다. 그러나 췌장 (pancreas)의 경우 세포내 Ca**2+ 이외에도 인접세포를 전기적, 화학적으로 연결시켜주는 gap junction이 외분비 기능을 직접적으로 조절할 가능성이 제시되었다. 타액선세포에서도 세포막에 고농도의 gap junction이 존재하고 있으며, gap junction을 통해 인접세포를 전기적, 화학적으로 연계되어 있어 gap junction이 타액선세포의 기능을 직접적으로 조절할 가능성을 내포하고 있다. 따라서 gap junction이 타액선의타액분비작용에도 중요한 역할을 하며 이러한

작용이 세포내 Ca**2+ 농도를 조절하여 이루어질 것이라는 가정하에 이를 확인하는 실험을 시행하였다.

흰쥐 악하선에서 유리되는 타액양을 측정하기 위해서 악하선으로 혈액을 공급하는 동맥에 가는 관을 삽입하여 생리 식염수를 관류하면서 타액선관을 통해 타액을 채취하였다. 세포내 Ca**2+ 농도는 분리한 악하선 acini 내에 Ca**2+ 농도변화에 민감하게 반응하는 형광물질인 fora-2를 축적시키고 형광분석기를 사용하여 형광강도를 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. CCh 투여로 타액 분비가 증가하였을 때 gap junction을 봉쇄하는 약물인 octanol (1 mM)을 투여하면 타액분비가 봉쇄되었으며 이는 가역적 반응이었다.

2. CCh 투여로 세포내 Ca**2+ 농도가 증가하였을 때 1 mM octanol을 투여하면 세포내 Ca**2+ 농도가 CCh 투여전의 상태로 감소되었다

3. Octanol은 CCh에 의하여 유발된 초기 Ca**2+ 증가를 억제하지는 못한 반면에 후기 Ca**2+ 농도를 감소시켰다.

4. 세포막 Ca**2+ 통로를 열어주는 약물인 thapsigargin (1 μM)을 투여하여세 포내 Ca**2+ 농도를 증가시킨 후 1 mM octanol을 투여하면 세포내 Ca**2+ 농도가 thapsigargin 투여 전의 상태로 감소하였다.

5. 2,5-di-tert-butyl-1,4-benzohydroquinone (TBQ)의 투여로 세포막을 통한 Ca**2+ 농도의 주기적 변동인 Ca**2+ 의 oscillation이 유발되었는데, 이때 1 mM octanol을 투여한 경우에 Ca**2+ 농도의 oscillation이 정지하여 역시 gap junction을 봉쇄하면 TBQ에 의해서 유발된 세포내 Ca**2+ 농도의 주기적 변동이 사라지고 Ca**2+ 농도의 감소가 나타남을 확인하였다.

6. Gap junction을 봉쇄하는 또 다른 약물인 glycyrrhetinic acid (100 μM)도 CCh 자극으로 인한 타액분비를 억제하였다.

이상의 결과로 미루어 gap junction은 흰쥐 악하선 세포로부터의 타액분비조절에 중요한 역할을 하는데, 이는 gap junction이 세포막 Ca**2+ 통로를 조절함으로써 수용체 자극으로 유발된 세포내 Ca**2+ 농도 변화에 영향을 미친 결과인 것으로 추측된다.

[영문]

From bacteria to mammalian cells, one of the most important mediators of intracellular signal transduction mechanisms which regulate a variety of intracellular processes is free calcium. In salivary acinar cells, elevation of intracellular calcium concentration ([Ca**2+]^^i) is essential for the salivary secretion induced by parasympathetic stimulation. However, in addition to[Ca**2+]^^i , gap junctions which couple individual cells electrically and chemically have also been reported to regulate enzyme secretion in pancreatic acinar cells. Since the plasma membrane of salivary acinar cells has a high density of gap junctions, and these cells are electrically and chemically coupled with each other, gap junctions may modulate the secretory function of salivary glands. In this respect, I planned to investigate the role of gap junctions in the modulation of salivary secretion and [Ca**2+]^^i using mandibular salivary glands of rats.

In order to measure the salivary flow rate, fluid was collected from the cannulated duct of the isolated perfused rat mandibular glands at 2 min intervals. [Ca**2+]^^i was measured from the cells loaded with fura-2 by spectrofluorometry.

The results obtained were as follows;

1. CCh-induced salivary secretion was reversibly inhibited by 1 mM octanol, a gap junction blocker.

2. CCh-induced increase in [Ca**2+]^^i was also reversed by the application of 1mM octanol.

3. Octanol did not block the initial increase in [Ca**2+]^^i caused by CCh, which suggested that the reduction of [Ca**2+]^^i caused by gap junction blockade was not resulted from the inhibition of Ca**2+ release from intracellular Ca**2+ stores.

4. Addition of octanol during stimulation with 1 μM thapsigargin, a potent microsomal ATPase inhibitor, reduced [Ca**2+]^^i to the basal level. This suggested that inhibition of gap junction permeability closed plasma membrane Ca**2+ channels.

5. 2,5-di-tert-butyl-1,4-benzohydroquinone (TBQ) generated [C**2+]^^i oscillations resulting from periodic influx of Ca**2+ vla plasma membrane. The TBQ-induced [Ca**2+]^^i oscillations were stopped by the application of 1mM octanol which implicated that gap junctions modulate the permeability of plasma membrane

Ca**2+ channels.

6. Glycyrrhetinic acid, another well known gap junction blocker, also inhibited CCh-induced salivary secretion from rat mandibular glands.

These results suggested that gap junctions play an important role in the modulation of fluid secretion from the rat mandibular glands and this was probably due to the inhibition of Ca**2+ influx through the plasma membrane Ca**2+ channels.