산발성 유방암에서 유세포분석기를 이용한 BRCA1 단백의 측정

Abstract

[한글]

유방암은 여성에서 흔하게 발생되는 종양으로 가족성 유방암과 산발성 유방암으로 나눌 수 있으며 가족성 유방암의 45% 이상에서 염색체 17번의 q21에 존재하는 BRCA1 유전자의 변이가 관찰되고 있다. BRCA1 유전자에 관한 연구는 실제 일부 유방암 가계에서 젊은 연령, 양측 발생, 남자에서 발생되는 점을 관찰하여 이에 대한 연관 분석을 함으로써 이루어졌다. 최근 BRCA1유전자의 구조 및 염기 서열이 완전히 밝혀졌고 BRCA1 유전자에서 합성되는 BRCA1 단백의 구조가 밝혀짐에 따라 BRCA1 단백의 세포내 분포 및 기능에 대한 연구가 진행되고 있다. 이제까지 BRCA1 단백의 측정은 웨스턴 면역블롯팅이나 현미경적 면역형광법에 의해 이루어져 왔으며, 특히 BRCA1단백의 세포내 분포에 관한 연구는 주로 현미경적 면역형광법에 의하여 시행되어 왔다. 그러나 웨스턴 면역블롯팅은 시간이 오래 걸리며 면역형광법은 검체의 고정, 전처리 술식 및 판독자의 차이에 따라 해석이 달라질 수 있는 단점이 있다. 이에 본 연구자는 보다 많은 세포를 객관적으로 분석할 수 있는 유세포분석기 (Coulter Epics-XL, Coulter Corps, Miami, FL, USA)를 이용한 BRCA1 단백 측정을 시도하고 이를 통한 세포내 분포에 대해서 연구하고자 하였다.

대상 검체는 양성 유방조직 6 건과 악성 유방암 조직 28 건이었으며 검체는 -75℃에 냉동 보관 후 해동하여 검사하였다. 즉, 세포부유액과 BRCA1 단백 항체 (BRCA1(Ab-1), Calbiochem, Cambridge, MA, USA)를 반응시켰으며 세포의 전처리 투과 정도를 조정함으로써 세포질 혹은 핵내의 분포상태를 관찰하였다. 동시에 DNA 분석을 실시하여 DNA 배수성과 BRCA1 단백의 발현 정도 및 위치와의 상관성을 알아보았다.

그 결과 양성 유방 조직에 비하여 악성 유방암 조직의 세포질 BRCA1 단백 발현이 더욱 풍부하였다 (95% channel fluorescence; 양성: 0.40±0.13, 악성: 0.65±0.26, p=0.0211, 세포질과 핵의 비율; 양성: 0.29±0.19, 악성: 0.50±0.21, p=0.0196). 또한 세포질 BRCA1 단백 양성율은 병기의 진행에 따라 달라 제 I 기 (32.6±9.8%)에 비해 제 Ⅱ 기 (48.3±18.8%, p=0.048) 및 Ⅲ 기(47.0±10.9%, p=0.010)에서 유의한 중가를 보였다. 그러나 BRCA1 단백은 비배수성 (aneuploidy) 유무, 조직학적 등급, 세포의 5-주기 백분율, 및 증식 분획 (proliferation fraction)과는 유의한 상관성이 없었다.

이상의 결과를 종합하여 볼 때, 유세포 분석기를 이용한 유방 조직 세포내 BRCA1 단백 측정법은 그간 이용해 온 현미경적 면역형광법의 대체 방법의 하나로서 활용 가능성이 있으며, 유방암 조직의 세포질 BRCA1 단백의 증가현상은 악성 유방암의 발생 또는 진행과 연관이 있을 것으로 생각되었다. 향후 임상적으로 보다 많은 유방암 환자를 대상으로 병기, 치료 반응 및 예후와 관련시켜 BRCA1 단백 발현 정도를 잔찰하므로써 악성 유방암의 발생, 진행, 및 치료를 위한 하나의 독립적 지표로서의 활용 가능성에 대한 연구가 더욱 진행되어야 할 것으로 사료된다.

[영문]

Inactivation of the BRCA1 gene, located at chromosome 17q21, is responsible for some forms of familial or sporadic breast cancer, The BRCA1 gene contains 23 coding exons, which codes for a protein of 1863 amino acids. The function of the BRCAI protein is not yet known, but decreased expression of BRCA1 leads to accelerate growth of mammary cells in vitro while loss of expression is observed during progression from benign disease to metastatic breast cancer. Recently, some investigators have developed BRCA1 specific antibodies and studied the subcellular localization and function of BRCA1 protein with immunoblotting or

immunofluorescence staining. However, accurate cellular assessment of BRCA1 protein depends on antibody specificity as well as on method of fixation and staining Therefore it is important to standardize the method of analysis in relation to

pre-existing procedures and reagents.

In this study, the expression of BRCA1 protein was analyzed with the flow cytometry (Coulter Epics-XL, Coulter Corps, FL, USA) using the monoclonal antibody (BRCA1(Ab-1), Calbiochem, MA, USA) before and after nuclear and cytoplasmic permeabilization in association with DNA ploidy analysis. Several BRCA1 protein indices were derived including 95 percentile channel fluorescence (95%CF) and mean channel fluorescence(MCF) and percentage of BRCA1 positive cell population arbitarily definedas those above 0.12 channel fluorescence.

The results were as follows;

1. Cytoplasmic 95% CF were higher in breast cancer (n=28, 0.65±0.26)than in benign lesions of the breast (n=6, 0.40±0.13, p=0.0211).

2. Percentages of cytoplasmic BRCA1 positive cells were significantly higher in breast cancer (24.0± 10.3) than in benign lesions of the breast(43.4 ± 15.2, p=0.0059).

3. Cytoplasmic BRCA1 positive cell percentages were significantly different according to the stages (stage I vs Ⅱ, 32.6±9.8 vs 48.3± 18.8,p=0.048, stage I vs stage Ⅲ, 32.6 ±9.8 vs 47.0± 10.9, p=0.010).3. The BRCA1 protein indices were not significantly correlated with histologic grades and DNA indices and proliferative indices.

In conclusions, flowcytometric assay offers an alternative approach toevaluating BRCA1 protein status of breast cancer tissue and detection ofcytoplasmic BRCA1 protein by this method may help to understand the role of BRCAI In breast cancer cell biology. The further study on cytoplasmic or nuclear BRCA1 protein in association with clinical therapeutic response or prognosis seems to be warranted.