Na+/H+ exchanger와 HCO3- transporter에 의한 흰쥐 타액선 선세포내 pH 조절

Abstract

[한글]

타액선 선세포를 비롯한 생체를 구성하는 모든 세포의 기능은 여러 효소의 활성에 크게 의존하며 또 이 효소들은 대개 단백질로서 그 입체구조 및 활성은 용액의 H**+ 농도에 많은 영향을 받는다. 따라서 세포 내에서 산-염기의 평형이 깨지면 그로인해 효소활성이 조화롭게 이루어지지 못하고 결국 세포에 치명적인 결과를 야기할 수 있게 된다. 그러므로 세포는 H**+ 농도 또는 pH를 조절할 수 있는 장치를 가지고 있는데 이 중 Na**+ /H**+ exchanger가 대표적이다. 특히 이 exchanger는 무스카린성 수용체의 자극으로 타액 분비가 항진될 때 활성화되는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구의 목적은 무스카린성 수용체 자극으로 Na**+ /H**+ exchanger가 얼마나 활성화되는지 알아보고 Na**+ /H**+ exchanger 외에도 세포내 pH 조절에 관여하고 타액내 HCO^^3**- 이온농도를 높여 치아우식증 예방에 관여할 것으로 생각되는 HCO^^3**- cotransporter의 유무를 확인하는 것이다.

흰쥐 수컷의 악하선에서 선세포를 분리하여 세포내 pH를 측정하는데 사용하는 형광물질인 2', 7'-bis(2-carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein (BCECF)를 세포내 축적시킨 후 악하선 선세포를 perfusion chamber에 넣고 현미경 상에서 세포내 pH 변화를 spectrofluorometer를 사용하여 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. HCO^^3**- /CO^^2 투여로 세포내 pH가 0.39±0.02 pH unit 감소한 후 0.04±0.007pH unit/min의 속도로 증가하였으며 Na**+ /H**+ exchanger 봉쇄제인 1 mM amiloride와 HCO^^3**- transporter 봉쇄제인 200 μM 4, 4'-diisothiocyanato-stilbene-2, 2'-disulphonic acid (DIDS)를 투여한 경우 세포내 pH 증가가 억제되어 pH 증가속도가 0.01±0.002 pH unit/min이었다.

2. 관류액에 NH^^4**+ 이온의 첨가와 제거로 세포내 pH가 감소하였는데 HCO^^3**-가 포함되지 않은 용액을 관류했을 경우 1 mM amiloride에 의해 pH 증가가 거의 완벽하게 봉쇄되어 세포내 pH 증가가 전적으로 Na**+ /H**+ exchanger에 의함을 알 수 있었다.

3. 10 μM carbachol 투여로 세포내 pH 증가속도가 0.16±0.01 pH unit/min에서 0.28±0.03 pH unit/min로 빨라졌다.

4. 10 μM carbachol을 투여한 경우 1 mM amiloride의 첨가로 세포내 pH 감소속도가 0.06±0.008 pH unit/min으로서 이는 carbachol 투여 전의 0.03±0.004 pH unit/min 보다 빨랐다.

5. 세포내 H**+ 이온에 대한 완충능 (buffering capacity) βi은 세포내 pH가 7.2-7.4 일 때 14.31±1.82 이었으며 세포내 pH가 낮아질수록 βi 값이 증가하였다.

6. 10 μM carbachol 투여로 Na**+/H**+ exchanger를 통한 H**+ 이온의 유출속도가 carbachol 투여 전 보다 크게 증가하여 Na**+/H**+ exchanger의 활성도가 carbachol 투여로 alkaline shift되었음을 확인하였다.

7. 흰쥐 악하선 선세포에서 세포내 pH를 조절하는 장치로 HCO^^3**-를 유입시키는 이동단백질이 있음을 확인하였다.

이상의 실험결과로 미루어 보아 흰쥐 타액선 선세포에서 세포내 pH를 유지하는데 가장 중요한 역할을 하는 Na**+ /H**+ exchanger가 무스카린성 수용체의 자극으로 타액분비가 항진될 때 그 활성이 크게 증가하여 세포내 pH가 7.25에서 3배 가량 활성도가 커짐을 알 수 있었다. 또한 세포내 pH 조절에도 관여하며 타액내 pH를 유지시키는 데에도 중요한 역할을 하는 HCO^^3**- 이온을 세포내로 유입시키는 이동단백질이 있음을 확인하였으나 이 이동단백질이 세포내 어떤 기전에 의해 조절되는지는 앞으로 계속 연구해야할 과제로 생각한다.

[영문]

Intracelluar pH (pHi) plays an important role in the regulation of cellular processes by influencing the acitivity of various enzymes in cells. Therefore, almost every type of mammalian cell possesses an ability to regulate its pHi. One of the most prominent mechanisms in the regulation of pHi is Na**+ /H**+ exchanger. This exchanger has been known to be activated when cells are stimulated by the binding of agonist to the muscarinic receptors. Therefore, the aims of this study were to compare the rates of H**+ extrusion through Na**+ /H**+ exchanger before and during muscarinic stimulation and to investigate the possible existence of HCO^^3**- transporter which is responsible for the continuous supply of HCO^^3**-ion to saliva.

Acinar cells were isolated from the rat mandibular salivary glands and loaded with pH-sensitive fluoroprobe, 2', 7'-bis(2-carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein (BCECF), for 30 min at room temperature. Cells were attached onto the coverglass inthe perfusion chamber and the changes in pHi were measured on the iverted microscope using spectrofluorometer.

1. By switching the perfusate from HCO^^3**- -free to HCO^^3**- -buffered solution, pHi decreased by 0.39±0.02 pH units followed by a slow increase at an initial rate of 0.04±0.007 pH units/min. The rate of pHi increase was reduced to 0.01±0.002 pH units/min by the simultaneous addition of 1 mM amiloride and 100 μM DIDS.

2. An addition and removal of NH^^4**+ caused a decrease in pHi which was followed by an increase in pHi. The increase of pHi was almost completely blocked by 1 mM amiloride in HCO^^3**- -free perfusate which implied that the pHi increase was enticed dependent on the activation of Na**+/H**+ exchanger in HCO^^3**- -free condition.

3. An addition of 10 μM carbachol increased the initial rate of pHi recovery from 0.16±0.01 pH units/min to 0.28±0.03 pH unit/min.

4. The initial rate of pHi decrease induced by 1 mM amiloride was also increased by the exposure of the acinar cells to 10 μM carbachol (0.06±0.008 pH unit/min) compared with that obtained before carbachol stimulation(0.03±0.004 pH unit/min).

5. The intracellular buffering capacity β1 was 14.31±1.82 at pHi 7.2-7.4 and β1 increased as pHi decreased.

6. The rate of H**+ extrusion through Na**+/H**+ exchanger was greatly enhanced by the stimulation of the cells with 10 μM carbachol and there was an alkaline shift in the activity of the exchanger.

7. An intrusion mechanism of HCO^^3**- was identified in rat mandibular salivary acinar cells.

Taken all together, I observed 3-fold increase in Na**+/H**+ exchanger by the stimulation of the acinar cells with 10 μM carbachol at pH 7.25. In addition, I have found an additional mechanism for the regulation of pHi which transported HCO^^3**- into the cells.