흰쥐 귀밑샘에서 자유유리기 제거제가 방사선 조사로 유도된 세포자멸 발현에 미치는 영향

Abstract

[한글]

다핵기관이 생물학적 평형을 유지하기 위해서는 필요하지 않는 세포들의 제거과정이 필수적이며 이는 발생이나 생후 발육 과정 중 정상조직을 재형성하는 과정에서 나타나는 생리학적 세포 변화의 한 유형인 예정된세포죽음 (Programmed cell death)으로 정의 내려진다. 이는 생리학적, 유전적인 조절 기전으로 독소, 유해 화학물질, 암유발물질, 약물, 이온화방사선 등이 성숙한 세포에서 인위적인 세포자멸 (apoptosis)을 유발하는 것으로 알려져 있다. 특히, 머리와 목 부위의 암을 치료하기 위해 사용하는 치료방사선은 조사후 구강건조증(xerostomia)을 일으키며 이 과정은 방사선에 의한 침샘세포의 인위적인 세포자멸에 의한 것으로 보고되고 있다.

따라서 이 연구는 이온화 방사선에 의한 침샘의 손상을 차단하고 이에 따르는 합병증을 줄이기 위하여 실험 동물의 침샘을 흡수선량 20 Gy의 이온화 방사선에 노출시켜 세포자멸을 인위적으로 유도하고 이에 따르는 조직의 변화 과정 및 세포부착물질의 발현양상 변화를 관찰하여 그 기전 및 성상을 형태학적으로 이해하고자 하였다. 또한 방사선에 의한 세포자멸을 차단시키는 물질로 알려진 allopurinol, Cu/Zn superoxide dismutase, 그리고 dimethylthiourea를 방사선조사 전에 실험동물에 전처치하여 방사선으로 유도되는 세포자멸의 발현을 억제시키고자 하였다. 이러한 세포자멸의 증거를 확인하기 위해 광학현미경 상에서는 Hematoxylin-Eosin (H-E) 염색과 TUNEL (Tdt-meiated dUTP-biotin Nick End Labeling) 염색을 이용하여 세포자멸체 (apoptotic body)의 존재를 관찰하였으며 통상의 전자현미경 관찰과 E-cadherin의 발현을 확인하기 위해 전자현미경적 면역조직화학 염색

을 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 광학현미경에서 방사선에 유도된 흰쥐 귀밑샘의 세포자멸체는 TUNEL 염색에 강한 양성 반응을 보였으며 대부분의 세포자멸은 샘세포에만 국한되어 있었고 사이관, 줄무늬관 등의 샘관구조에서는 극소수가 관찰되었다.

2. 자유유리기 제거제 전처치에 상관없이 방사선을 조사한 모든 실험군에서 세포자멸체의 출현은 방사선조사 후 24 시간까지 증가하다가 이후에는 감소하였다.

3. Xanthine oxidase에 의한 초산화물 (superoxide) 음이온 생성을 촉진시키는 반응을 억제하는데 효과가 있는 것으로 알려진 allopurinol을 방사선조사 전에 실험동물에 전처치한 결과, 방사선에 의해 유도되는 침샘의 세포자멸 과정을 억제하지는 못하였다.

4. 세포외부에서 발생되는 초산화물을 효과적으로 제거하는 superoxide dismutase (SOD)와 수산화 자유유리기를 제거하는 효과를 가진dimethylthiourea (DMTU)를 방사선 조사전 실험 동물에 각각 전처치한 결과, 두가지 약물 모두 방사선에 의한 침샘 세포의 세포자멸 발현을 억제하였으며 (P<0.001), 방사선에 의한 침샘 구조의 손상도 감소되었다.

5. 자유유리기 제거제의 약물 상협효과를 확인하기 위해 방사선 조사전 실험동물에 allopurinol과 SOD, S0D와 DMTU를 동시에 전처치한 결과, 방사선에 의해 유도되는 침샘세포의 세포자멸은 자유유리기 제거제를 전처치하지 않고 방사선조사를 시행한 실험군보다는 낮았으나 (P<0.001), 두 가지 약물의 상협효과는없었다.

6. 귀밑샘주위 림프절에서 관찰된 방사선에 의한 세포자멸체의 발현 양상은 대부분 림프소절을 포함한 바깥 겉질층에 밀집되어 있었으며 방사선조사에 의한 침샘세포의 세포자멸 현상보다 더욱 빨리 진행되었다. 림프절에서 관찰한 세포자멸체들은 대부분 림프구보다는 세포가 소멸되는 과정 중 떨어져 나온 많은 수의 작은 조각들을 함유한 조직구 또는 대식세포들이었다.

7. 전자현미경적 미세구조 상, 방사선조사 후 귀밑샘에서 관찰된 세포자멸체는 축합된 염색질을 포함하는 막에 둘러싸인 핵조각들과 공포들을 포함하고 있으며 그 외 세포소기관들을 다수 포함하고 있었다.

8. 방사선을 조사한 모든 실험군에서 면역조직화학 염색을 퉁한 전자현미경적관찰에서 세포자멸을 보이지 않은 정상 샘세포들은 인접한 세포들과 세포사이연접을 통해 부착되어 있었으며 세포부착물질인 E-cadherin의 발현은 부착반점에 밀집되어 나타났다. 그러나 방사선으로 유도된 세포자멸체의 세포막에서는 형태학적으로 세포사이연접이 관찰되지 않았으며 세포부착물질의 발현 또한 나타나지 않았다.

이상의 결과를 종합하여 볼 때, 흰쥐 침샘에서 이온화 방사선으로 유도된 세포자멸은산소 또는 수산화 자유유리기에 의한 일차적인 세포손상의 결과로 예상되며 자유유리기 제거제의 전처치는 방사선에 의한 세포자멸을 차단할 수 있다는 사실을 확인하였다. 그러나 allopurinol을 전처리하였을 때, 방사선에 의한 세포자멸 양상이 감소되지 않은 것으로 보아 방사선에 의해 생성된 산소 자유 유리기는 xanthine oxidase 과정을 통해 형성된 것이 아님을 알 수 있었다. 따라서 세포자멸에는 여러 가지 요인이 작용할 것으로 추측되며 특히 이 과정중 세포사이연접내의 세포부착물질 발현의 감소를 형태학적으로 확인하였다. 그러므로 방사선에 의한 초기 세포자멸 과정을 통해 세포의 자가소실과정이 유발되고, 이 과정에서 일어나는 일련의 세포 반응들에 의하여 기능적 손실이 유발될 것으로 예상된다.

[영문]

The selective processes of unwanted cel1 deletion termed as a programmed cell death must be established for biological eqilibrium in muticellular systems. It plays a role in the control of shape and size, and exerts a homeostatic function in relation to tissue dynamics. And this is achieved by a balance between cell replication and cell death. Apoptosis is a one of distinct morphological form of programmed cel1 death during growth and development and some diseases. Also, it is wel1 known that the apoptosis is usually caused by carcinogens, drugs, heat and radiation in mature celIs. EspecialIy, the therapeutic radiation of the head and neck region may cause xerostomia after irradiation.

Recently, there are many trial reports to explain the radiation cel1 death to the acute cellular changes as a programmed cell death. But, while most previous studies trended to understanding the mechanism of the apoptosis by handling the gene, this study focused on the intercellular communication to solve the expression mechanism of apoptosis.

The author performed present study to investigate the potential role of reactive oxygen metabolites as a signal for radiation-induced apoptosis. A series of antioxidants, allopurinol, superoxide dismutase, dimethylthiourea, were pretreated before γ-irradiation for evaluating their ability to block apoptosis in the rat parotid gland in vivo, and the light microscopic results were evaluated and analyzed using the Tdt-mediated dUTP-biotin nick end labeling technique. Also, to understand the biological mechanisms of the radiation-induced apoptosis, expression of cell adhesion molecules (CAMs) especially, E-cadher in, which lie at the intercellular junctional complexes that have a importance of intercellular communication and cellular adhesion was compared between apoptotic cells and non-apoptotic cells by electron microscopic observations.

The results were as follows.

1. Light microscopicalIy, irradiation induced apoptotic bodies in the parrotid gland were revealed the intensively positive reaction on the TUNEL technique, and most apoptotic bodies were confined in the acinar system, there were rare apoptotic changes in the ductal system.

2. In all irradiated experimental groups without antioxidants pretreatment, the number of the apototic bodies was the greatest in post-irradiation 24 hour group, and then decreased as a function of time.

3. As a result on pretreatment of allopurinol that effectively inhibit xanthine oxidase before irradiation, failed to block the irradiation-induced apoptosis in the rat parotid gland. Moreover, in the postirradiation 1 day group, the apoptotic expression and destruction of the acini increased than non-irradiated experimental group.

4. As a result on pretreatment of superoxide dismutase that contributes to extracelluarly generated superoxides and dimethylthiourea to scavenge the hydroxyl free radicals before irradiation, two antioxidants inhibit the irradiation-induced

apoptosis (P<0.001), salivary acinar structures remained intact.

5. To evaluate the synergistic effect, simulianeous pretreatment of allopurinol and SOD, SOD and DMTU were conducted. Expression of irradiation-induced apoptosis was lower than the experimental group which not pretreated any antioxidants (P<0.001). but there was no synergism of two antioxidants.

6. 1rradiation-induced apoptotic bodies crowded at the outer cortical layer including lymphatic nodules, and the aspect of apoptotic expression in the lymph node took place earlier than in the salivary acini.

7. On the electron microscopic views of the irradiated experimental groups, membrane-bounded masses of apoptotic bodies with smal1 cellular fragments including condensed chromatin and cellular organelles were observed. In the irradiated group, while the lateral surface between adjacent non-apoptotic serous acinar cells demonstrated a junctional complexes, intercellular junctions of the appptotic cells were not observed morphologically,

Taken al1 together, it is forecasted that the irradiation-induced apoptosis of the parotid gland is a resu1t of primary cellular damage by oxygen or hydroxyl free radicals, Through this study, the facts that pretreatments of free radical scavengers block the irradiation-induced apoptosis were identified. But, oxygen free radicals were not produced via xanthine oxidase process, whereas, allopurinol that inhibits this reaction influeced the harmful effects to the parotid gland. In addition, it is speculated that various extracellular or intracellular factors applies to the apoptosis. Especially, possible role that the intercellular communications through the intercellular junctional complexes have a role in the signal transmission and cel1 death was morphologicalIy verified. These results give us to reflect that the cellular self-deletions induced by irradiation cause the clinically significant functional loss. Therefore, further studies for the functional charges by the increased expression of the apoptosis wi11 be proceeded.