Interleukin-12, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor 및 Herpes simplex virus-thymidine kinase를 발현하는 종양세포 살상 아데노바이러스와 전약제인 Ganciclovir의 병합치료에 의한 항 종양 효과

Abstract

[한글]암은 종양 내 면역 억제 환경(immunosuppressive tumor microenvironment)을 조성함으로써, 다양한 숙주 면역반응을 회피하고, 파괴하며, 결과적으로 종양의 생존을 촉진 하는 특징을 가진다. 따라서 최근에는 종양 내 면역 억제환경을 개선하여 암세포에 대한 면역반응을 증진 시키고자 interleukin (IL)-12, IL-18, IL-23, interferon-gamma(IFN-γ), granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF), tumor necrosis factor(TNF) 와 같은 사이토카인 유전자, B7분자와 같은 동 자극 유발 인자, 직접적으로 APC의 역할을 하는 수지상세포(DC), 종양항원으로 활성화시킨 T Cell등을 이용하여 향상된 항암 면역치료 효과를 얻고자 하는 다양한 연구가 진행 되고 있다. 하지만 이러한 노력에도 불구하고, 여전히 종양 면역치료는 종양의 낮은 면역원성으로 인하여 치료 효과가 제한 되고 있는 실정이다. 따라서, 종양의 면역억제 환경을 개선함과 더불어, 종양의 면역원성을 높여 치료효과를 높이기 위해 최근에는 종양 특이적 아데노바이러스를 이용한 면역치료와 함께 방사선 치료, 항암 화학 요법 등을 병행하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 따라서, 본 연구에서는 종양 특이적 살상 능과 특이성이 보다 개선 된 RdB 아데노바이러스를 이용하여 일차적으로 감염된 세포뿐만 아니라 바이러스의 증식에 따른 종양특이적 세포살상과E1부위에 IL-12, E3부위에 GM-CSF를 도입하여, 숙주의 종양특이적 면역체계를 활성화 시켜 항종양 효과를 증대 시키고, 약제 감수성 유전자인 HSV-TK 유전자를 아데노바이러스 E3부위에 동시에 도입하여, ganciclovir(GCV)의 병용 투여로 인한 세포 살상 효과와 바이러스에 감염되지 않은 암세포까지 bystander effect를 통한 세포살상으로 극대화된 항종양 효과를 유도하고자 하였다. C57BL/6 마우스의 LLC 종양 모델에서 항종양 효과를 검증한 결과, RdB/IL12/GMCSF 에 비해 RdB/IL12/GMCSF-TK바이러스를 투여한 경우 증대된 항종양 효과를 관찰할 수 있었으며, RdB/IL12/GMCSF-TK바이러스와GCV를 병용 투여한 경우 더욱 증대된 항종양 효과가 유도됨을 확인하였고, 병합치료 군의 5마리 중 3마리는 종양이 완전히 사라짐을 관찰하였다. 또한, 생체 내 생존율 검증 실험에서도 역시 RdB/IL12/GMCSF-TK+GCV병합치료 군에서 가장 높은 생존율을 관찰할 수 있었다. 그렇다면, 이러한 극대화된 항종양 효과 유도가 생체 내의 어떠한 변화에 의한 것인지 검증하고자, 종양 조직 절편의 H&E염색과 과 면역 화학 염색법을 시행한 결과, RdB/IL12/GMCSF-TK+GCV병합치료 군에서 종양조직의 괴사가 조직 전반적으로 넓게 관찰되었을 뿐만 아니라, 종양 조직 내로의 림프구의 침윤이 확연히 증가된 것을 관찰할 수 있었다. 침윤된 림프구의 세포 군들을 면역 조직 화학 염색법(immunohistochemistry, IHC)을 통하여 관찰한 결과, 확연히 증가된CD4+와 CD8+ T세포를 확인할 수 있었으며, TUNEL assay를 통한 세포고사를 확인해본 결과, 대조 군에 비하여 병합치료 군에서 종양 주위뿐 아니라 종양 내 전반적으로 세포고사가 일어났음을 확인할 수 있었다. 또한 종양 내 사이토카인 발현을 조사해 본 결과, 숙주의 면역 활성과 항 종양 효과에 중요한 사이토카인으로 알려진IL-12, GM-CSF, IFN-γ 발현이 다른 대조군에 비해 현저하게 증가함과 동시에 종양의 성장을 촉진시킬 수 있는 사이토카인으로 알려진TGF-β 의 경우 PBS에 비해 치료군에서 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다. 이렇게 종양 내 면역체계를 활성 시킬 수 있는 사이토카인의 발현을 통해 면역억제가 개선 된 종양 내에서 암세포 특이적인 CD4+, CD8+ T 세포는 Type-1 면역 반응을 유도하고 효율적으로 종양 살상을 유도하며, 바이러스의 종양특이적 살상과 GCV로 인한 극대화된 살상효과로 종양 면역원성이 증가함에 따라 결과적으로, 종양특이적 면역활성이 단독치료에 비하여 더 극대화 되었음을 알 수 있었다. 따라서 본 연구에서 이용된 RdB/IL12/GMCSF-TK와 전약제의GCV의 병합 치료는 종양 선택적 아데노바이러스인 RdB에 의해 유도되어지는 종양 세포 특이적 살상 효과뿐만 아니라, 종양 내 면역 억제를 개선시키고 항종양 효과를 유도하는 IL-12, GM-CSF의 종양 세포 특이적 고 발현과 종양 내 TK의 발현으로 인한 GCV의 활성으로 종양의 면역원성이 증대되고, 효율적인 면역활성을 유도함으로서 한 층 더 증대 된 종양 세포 특이적 항종양 효과를 유도할 수 있으며, 기존의 단독 면역치료 요법, 방사선 요법, 항암화학 요법에서의 제한된 치료를 극대화 시킬 수 있을 것으로 예상되다. 또한, 증대된 항암 면역반응으로 국소적인 암의 치료는 물론 전이 암의 치료 및 암의 재발 억제에도 유용하게 이용 될 수 있을 것으로 사료된다.

[영문]