텔로머라제 음성인 ALT 세포주에서 염색질 구조가 텔로미어 길이 조절에 미치는 영향

Abstract

[한글]텔로미어 (Telomere)는 진핵생물 염색체 끝부분의 DNA와 단백질 복합체로서 TTAGGG의 반복 서열을 가지며 염색체가 손상되는 것을 막아 줌으로써 유전체의 안정성에 기여를 한다. 대부분의 불멸화된 세포는 텔로머라제 (Telomerase)를 활성화 시킴으로써 텔로미어 길이의 안정화를 유도하지만 소수의 세포에서는 텔로머라제와 무관하게 텔로미어 길이를 유지하게 된다. 후자의 경우 Alternative lengthening of telomere (ALT)라 불리는 기작에 의해 텔로미어 길이 조절이 이루어진다. 텔로미어 길이조절은 여러 요소들에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 최근에는 텔로미어 염색질 구조와 텔로미어 길이가 밀접한 관계가 있음이 밝혀졌다. 텔로미어 유지는 발암과정에 있어서 중요한 요소이며 중요한 항종양 표적이 될 수 있어 텔로미어 길이 조절에 관한 기작 이해가 필요하다. 하지만 ALT 세포에서 텔로미어 염색질의 구조 변이가 텔로미어 길이 변화에 어떤 영향을 미치는지에 관한 연구는 전무한 상태이다. 본 연구에서는 ALT세포주에 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제 (histone deacetylase inhibitor) 인 Trichostatin A (TSA)를 처리하여 염색질의 구조 변이를 유도하고 그 변이에 따른 텔로미어 길이, APBs (ALT associated PML bodies) 형성, T-SCE (Telomere Sister Chromatid Exchange) 빈도를 측정하여 대조군과 비교 분석하였다. 이때 APBs형성을 측정하기 위하여 FISH combined IF (Fluorescence in situ Hybridization-Immunofluorescence staining, FISH-면역형광염색법)를 수행하였고, T-SCE 를 측정하기 위해 CO-FISH (Chromosome Orientation FISH)를 수행하였으며 텔로미어의 길이를 측정하기 위하여 텔로미어 FISH를 수행하여 TSA 처리하지 않은 대조군과 비교함으로써 ALT 세포주의 염색질 구조가 텔로미어 길이 조절에 미치는 영향을 보고자 하였다1. ALT 세포주인 GM 847과 WI38-VA13의 APBs를 측정하기 위하여 FISH-면역형광염색법을 수행하였다. GM 847 경우 TSA를 처리하였을 때 APBs 양성 세포수는 100개 중 63개로 TSA를 처리 하지 않았을 때의 100개중에 30개 보다 증가하였다 (p<0.001). 또 다른 ALT 세포인 WI38-VA13에서도 유사한 결과가 나타났다. WI38-VA13에 TSA를 처리 하였을 때 APBs 양성 세포수는 100개중 38로 TSA를 처리 하지 않았을 때의 100개중에 18개보다 증가하였다 (p<0.001). 2. GM 847의 T-SCE 빈도를 측정하기 위하여 CO-FISH를 수행하였다. TSA를 처리하였을 때 T-SCE 빈도는 1026개 염색체 중에 262개 (25.5%)로 TSA를 처리하지 않았을 때의 1026개중에 215개 (20.9%) 보다 증가 하였다 (p<0.001).3. GM 847의 텔로미어 길이를 측정하기 위하여 텔로미어 FISH를 수행하였다. TSA를 처리하였을 때 텔로미어 평균 길이를 나타내는 형광 평균 세기는 25.11%로 TSA를 처리하지 않았을 때의 29.8.% 보다 감소하였다 (p<0.001). 이상의 연구 결과는 ALT세포에서 염색질 구조가 텔로미어 재조합과 밀접한 관계가 있음을 보여주고 있다. 또한 이러한 결과는 텔로머라제 음성 세포주에서 텔로미어 길이 조절 메커니즘을 이해하는데 도움을 줄 것으로 생각된다.

[영문]Telomeres are DNA.protein complexes at the ends of linear eukaryotic chromosomes and composed of tandem repeats of a TTAGGG sequence ending in a 3’ single-stranded overhang, or the G-strand overhang. Telomeres confer chromosomal stability protecting chromosome ends. Maintaining telomere length is important process in tumorigenesis and it has been suggested that telomeres are important target for cancer therapy. Most immortalized human cell lines maintain and extend their telomere by activating telomerase, while a small number of cells maintain and extend their telomere lengths without telomerase by homologous recombination of telomeres, which is called as

alternative lengthening of telomere (ALT). Recently, it has been known that chromatin structure is closely related to regulation of telomere length. However, in ALT cells the effect of chromatin structure on regulation of telomere length is not understood. Here, we investigated the effect of chromatin structure on regulation of telomere length in telomerase negative ALT cells. We induced change of chromatin structure by treating Trichostatin A (TSA), Histone deacetylase inhibitor, in ALT cells. Then, we measured APBs (ALT associated PML bodies) patterns by FISH (Fluorescence in situ hybridization) combined IF (Immunofluorescence staining), T-SCE (Telomere Sister Chromatid Exchange) frequency by CO-FISH (Chromosome Orientation-FISH) and

telomere lengths by telomere FISH. We compared the number of APBs positive cells in ALT cells with or without TSA. In GM 847 (ALT cell), APBs positive cells were found to be more frequent in GM 847 with TSA (63/100) compared to GM 847 without TSA (30/100) (p<0.001). A similar result was found in other ALT cell line, WI38-VA13. APB positive cells were more frequent in WI38-VA13 with TSA (38/100) compare to WI38-VA13 without TSA (18/100), (p<0.001). Increased T-SCE frequency was found in GM 847 with TSA (262/1026, 25.5%) compared to GM 847 without TSA (215/1026,

20.9%), (p<0.001). however, decreased telomere length was found in GM 847 with TSA (telomere intensity mean 25.11%) compared to GM 847 without TSA (telomere intensity mean 29.8%), (p<0.001). This study demonstrated a close association between chromatin structure and telomere recombination in ALT cells and this result might provide insight into the mechanism of regulation of telomere length in telomerase-negative cells.