Identification of the amino acid sequence motif of α-synuclein responsible for macrophage activation

Abstract

[한글]만성 염증은 Parkinson’s disease (PD)나 Alzheimer’s disease와 같은 퇴행성 신경질환의 많은 부분과 연관되어 있다. 또한 활성화된 소교세포나 대식세포에서 분비되는 염증성 물질은 뇌신경세포의 사멸과 밀접한 관계가 있다. α-synuclein (Syn)은 PD 의 병인으로서 퇴행성 신경질환과도 연관되어 있다. 최근 연구에 의하면 α-synuclein은 소교세포를 활성화 시키며 도파민 작용성 퇴행성신경질환을 증가시킨다고 알려졌다. 그러나 α-synuclein에

의한 소교세포의 활성 기전은 아직까지 잘 알려져 있지 않았다. 이에 본 연구는 in vitro상에서 대식세포주 중의 하나인 RAW 264.7 세포와 일차 대식세포를 사용하여 α-synuclein 뿐만이 아니라 β-와 γ-synuclein도 대식세포를 활성화 시키는지를 확인하였다. 실험결과, 대식세포에 synuclein 단백질을 농도별로 처리하였을 때 분비되는 TNF-α와 PGE2의 양이 처리해준 단백질의 농도에 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 또한 synuclein 단백질은 COX2와 iNOS의 mRNA의 전사를 증가시켰다. α-synuclein 단백질의 결손형 돌연변이인 SynΔNAC와 Syn61-140은 RAW 264.7 세포와 일차 대식세포를 활성화 시켰고 syn61-140의 효과는 야생형이나 ΔNAC의 효과에는 다소 미치지 못하였다. 그러나 ΔNAC나 syn61-140과는 달리 Syn1-60과 Syn96-14 결손형 돌연변이체는 대식세포를 활성화 시키지 못했다. 또한 Synuclein 단백질의 점돌연변이체인 A30T, A53P, E46K는 α-synuclein 에 비해 대식세포를 더 강하게 활성화 시켰다.

마지막으로 α-synuclein에 의한 대식세포의 활성화는 ERK의 인산화를

동반한다는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 Synuclein 단백질들이

대식세포를 활성화 시키는데 있어서 α-synuclein의 N-말단 부위는 세포내로 들어가는데 필요하고, C-말단부위는 들어간 synuclein단백질이 대식세포를 활성화 시키는데 필요하며, N-말단부위가 결손 되어 있는 경우에는 세포 내로 synuclein 단백질이 들어가는데 있어서 NAC부위가 일정부분 이 역할을 수행할 수 있다는 것을 제시하고 있다.

[영문]Chronic inflammation is associated with a broad spectrum of neurodegenerative disorders, including Alzheimer’s and Parkinson’s diseases (PD). Activated microglia and macrophages produce various inflammatory molecules that are associated with neuronal cell death. α-Synuclein (Syn) is implicated in the pathogenesis of PD and related neurodegenerative disorders. Recent studies have also shown that α-synuclein can activate microglia and enhance dopaminergic neurodegeneration. The mechanisms of microglia activation by α-synuclein, however, are not well understood. In this study, we found that not only α-synuclein but also β- and γ-synucleins activated macrophages (RAW 264.7) in vitro. Macrophages treated with synuclein proteins secreted TNF-α and PGE2 in a dose-dependent manner. Synuclein family proteins also increased mRNA transcription of COX2 and iNOS. Two α-synuclein deletion mutants, Syn ΔNAC and Syn 61-140, activated primary macrophages, as well as RAW264.7 cells, although the effect of syn 61-140 is less prominent than those of wild type and ΔNAC. The other deletion mutants Syn 1-60 and Syn 96-140 did not significantly activate macrophages. In addition, the macrophage activating effects of α-synuclein point mutants A53T, A30P, and E46K were slightly higher than that of wild-type α-synuclein. Finally, we demonstrated that macrophage activation by α-synuclein was accompanied by phosphorylation of ERK. These results suggest that synuclein family proteins can activate macrophages via the ERK phosphorylation, and that macrophage activation needs both the N-terminal and C-terminal domains of α-synuclein.