탈회골기질에 의한 황색인대세포, 근모세포, 골모세포 및 간엽줄기세포에서의 골형성도

Abstract

[한글]골이식재가 자가골 이식을 대체할 수 있는 이상적인 골대체재가 되기 위해서는 골아전구세포, 골유도 인자 그리고 골전도 지지체라는 세 가지 요소를 포함하고 있어야 한다. 탈회골기질(demineralized bone matrix: DBM)은 골유도 기능 및 골전도 기능을 포함하면서 골유도 물질의 지속적인 유리 속도를 조절해 주는 장점이 있다. 이러한 탈회골기질의 장점을 이용하여 골형성 전구세포와 더불어 사용한다면 이상적인 골대체재로 사용이 가능하리라는데 착안하여 본 실험을 계획하였다. 골형성 전구세포로의 가능성을 알아보기 위해 황색인대세포, 근모세포, 골모세포 및 간엽줄기세포를 사용하였다. 상품화된 탈회골기질(RegenerationTM Technologies INC, Alachua, FL, USA)을 사용하였으며, 탈회골기질의 골형성 능력의 대표적 단백질인 골형성단백(bone morphogenetic protein: BMP)-2 함유량에 대한 분석을 시행하였다. 세포 배양을 위한 조직은 동의를 얻은 환자로 부터 수술적 치료 과정을 통해 획득한 후, 세포별 분리 및 배양 과정을 거쳐 냉동 보관 후 실험에 사용하였다. 세포별 골분화 과정에서는 골형성 배지만을 사용한 대조군과 탈회골기질을 추가하여 배양한 실험군으로 나누어 진행하였다. 배양 3일과 7일째 세포 증식 여부를 확인하기 위해 Cyquant 분석과 세포 골형성 표지자 측정(Collagen type I, Osteocalcin, Osterix, MSX2, Dlx5)을 위해 역전사 중합 효소 연쇄 반응(reverse transcriptase polymerase chain reaction: RT-PCR)을 시행하였다. 배양 2주째 alkaline phosphatase(ALP) 염색과 4주째 von Kossa 염색 및 염색 정도에 대한 정량 분석을 시행함으로 세포의 골형성도를

측정하였다. 본 실험에서 사용한 탈회골기질 내에는 BMP-2가 1.0667μg/g함유되어 있었다. 세포 증식 검사에서는 모든 세포의 대조군과 실험군에서 세포 독성 없이 시간이 흐름에 따라 세포수의 증가를 보였다. RT-PCR 결과에서는 모든 세포에서 실험군에서의 골형성 표지자의 증가 소견은 관찰되지 않았다. ALP 염색과 von Kossa 염색 결과에서는 황색인대세포와 근모세포에서 실험군에서 의미 있는 골형성능의 증가를 보였다. 그러나 골모세포 및 간엽줄기세포에서는 대조군과 실험군 모두에서 풍부한 골형성능을 보였으며, 두군 간 비교에서는 통계학적으로 의미 있는 차이는 보이지 않았고, 오히려 실험군에서 떨어지는 경향을 보였다. 추가적으로 세포 실험에서 의미 있는 결과를 보였던 황색인대세포와 골모세포를 대상으로 동물 실험을 진행하였다. 세포와 배양액을 탈회골기질과 혼합하여 동시에 누드마우스의 피하에 삽입하였으며, 4주 및 8주째 골형성 정도를 알아보기 위해 Hematoxylin and Eosin 염색, ALP 염색, 및 von Kossa 염색을 시행하였으며, 추가로 Osteocalcin 및 Bone sialoprotein에 대한 면역 염색을 통해 세포가 골모세포로 분화되었는지를 확인하였다. 결과에서 두 가지 세포 모두에서 탈회골기질 사이에서 골형성능을 가진 세포의 증식을 확인하였으며, 면역 염색을 통해 증식된 세포가 골모세포임을 확인할 수 있었다. 또한 세포를 직접 삽입한 군에서 대조군에 비하여 골형성이 조기에 발생함을 확인하였다. 결론적으로 탈회골기질은 위 4가지 세포의 증식 과정에 세포독성이 없음을 확인하였고, 4가지 세포 모두 탈회골기질과

동시 배양 시 골형성도를 나타내었으며 그 중 황색인대 와 근모세포는 탈회골기질 내 작은 양의 BMP-2 함유량에도 불구하고 골형성도의 증가를 확인할 수 있었다. 또한 이 두 세포는 탈회골기질과 직접 이식하는 과정에서도 세포수의 증식을 확인할 수 있었으며, 탈회골기질의 골형성능을 촉진시킴을 확인 할 수 있었다. 본 연구는 골형성 전구세포 연구에 아직까지 사용하지 않았던 사람 척추 기립근의 근모세포도 골조직 공학의 골형성 전구세포의 새로운 후보자로 사용 될 수 있다는 사실과 세포를 직접 탈회골기질과 더불어 혼합하여 임상에 적용할 수 있는 가능성을 확인함에 의의가 있겠다. 그러나 세포와 탈회골기질의 직접 이식은 탈회골기질 내 골형성 인자 함유량의 다양성이라는 단점으로 인해 아직까지는 자가골 대체 효과를 얻기에는 제한점이 있음을 알 수 있었다.

[영문]An ideal bone substitute should have three important properties, namely: osteogenetic potential, osteoinductive nature and osteoconduction to provide scaffold for bone formation. Demineralized bone matrix(DBM) has both osteoinductive, as well as an additional capability to release these osteoinductive factors in a controlled and timely manner. If we are able to use

the osteoprogenitor cells with DBM together, then we can have a combination which can be an ideal bone graft substitute.

Commercially available DBM was used in our study and we analyzed the content of BMP-2 in DBM. Tissue for cell culture was obtained during operative spinal procedures with the informed consent of the patients. Each cell obtained from the tissue was cultured primarily up to two phase and then cryopreserved. The cultured cells were divided into two groups for osteogenic differentiation. The control group used an osteogenic media only while the experimental group used an osteogenic media supplemented with DBM. Cellular proliferation was assessed by Cyquant assay. The Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction(RT-PCR) for collagen type I, osteocalcin, osterix, MSX2, and Dlx5 were performed on third and seventh day of osteogenic cellular culture. Alkaline phosphatase(ALP) staining at 2

weeks and von Kossa staining at 4 weeks, including quantification of staining results using Metamorph, were performed for the evaluation of osteogenesis effect.

The content of BMP-2 in DBM was extremely small amount of 1.0667μg/g.

Results of cyquant assay showed that there was no cytotoxic effect on various cell types and that there was an increase in cell number with time. Results of RT-PCR showed that there was no increase in number of various osteogenic markers in the experimental group as compared to the control group. The

results of ALP and von Kossa staining showed that there was a statistically significant increase in the number of ligamentum flavum cells and myoblasts in the experimental group. Although there was an adequate osteogenic potential in the osteoblasts and mesenchymal stem cells of both control and experimental group, but still a lower tendency of osteogenesis was found in

the experimental group(no statistically significant).

We also have an additional animal study with ligamentum flavum cells and myoblast which had good results in vitro. We inserted the mixture-culture media with cells and DBM into the subcutaneous space of nude mouse.

Hematoxylin and Eosin (H&E) stain, ALP stain and von-Kossa stain were performed in order to quantify the degree of mineralization at four and eight weeks. Additionally, immunostain for osteocalcin and bone sialoprotein were performed to confirm whether the cells would differentiate into osteoblasts.

Our results showed a proliferation of cells with osteogenic potential in both cells. Immunostaining results showed that the experimental group treated together with DBM showed proliferated cell osteoblasts, which had earlier osteogenic differentiation than the control group.

In conclusion, there was no evidence of any cytotoxicity during the co-culture of DBM with all four cells and a good osteogenic potential was seen in all four cells during co-culture with DBM. We could also see a significant increase in osteogenic potential of ligamentum flavum cells and osteoblast in spite of a small content of BMP-2 in DBM. Direct cell implantation by

ligamentum flavum cells and myoblasts showed cellular proliferation and increased early osteogenic potential

This finding gives us the myoblast of human erector muscle as a new candidate of osteoprogenitor cell in bone tissue engineering These also open up the possibility of direct cell implantation with DBM as a bone substitute clinically, but may prove also to be a limitation in terms its use with DBM as an autobone substitute due to its variable content of osteogenic protein.