Activation of local aldosterone system in podocytes under diabetic conditions

Abstract

[한글]서론: 최근의 연구들에 의하면 알도스테론이 당뇨병성 신병증의 발생 및 진행에 중요한 역할을 담당하는 것으로 보고되고 있다. 원래 알도스테론은 부신 피질의 사구층 세포에서 생성되는 것으로 알려져 있었으나, 생체 내외의 많은 연구를 통하여 부신 피질 이외에 혈관 내피세포, 혈관 평활근 세포, 그리고 심근세포에서도 생성이 일어나며, 이러한 국소적 알도스테론 생성이 각종 심혈관계 질환의 발생과 관련이 있는 것으로 보고되고 있다. 신장에서는 사구체 혈관사이 세포와 세뇨관 세포에 알도스테론 합성에 가장 중요한 효소인 aldosterone synthase (CYP11B2)가 존재하는 것으로 미루어 보아, 이들 세포에서도 국소적 알도스테론 합성이 이루어질 것으로 생각되나, 족세포에서의 국소적 알도스테론 생성에 대한 연구는 아직까지 극히 미미한 실정이다. 또한, 최근의 연구에 의하면 당뇨 흰쥐에서 추출한 신장 내 CYP11B2의 발현이 증가되는 것으로 알려져 있으나, 당뇨 조건 하에서 어떠한 신장 세포에서 CYP11B2의 발현이 증가되는 지에 대한 연구는 전무한 상태이다. 이에 본 연구자는 고포도당 조건 하에서 배양한 족세포 및 당뇨 흰쥐의 사구체에서 레닌-안지오텐신계가 활성화되면서 국소적 알도스테론계의 활성화가 동반될 것이라는 가정하에 족세포 내 CYP11B2와 mineralocorticoid receptor (MCR)의 존재를 확인함과 동시에 생체 내외의 실험을 통하여 당뇨 조건 하에서 이들의 발현 변화를 관찰하고자 하였다.

방법: 생체 외 실험으로는 불멸 생쥐 족세포 (immortalized mouse podocytes)를 정상 포도당군 (5.6 mM), 정상 포도당 + 만니톨군 (24.4 mM 만니톨), 정상 포도당 + 안지오텐신 (10-7 M), 그리고 고포도당군 (30 mM)으로 나누어 배양하였으며, 각 군에 안지오텐신 제 1형 수용체 차단제 (10-7 M L-158,809)를 6시간 전처치한 족세포도 배양하였다. 생체 내 실험으로는 16마리의 Sprague-Dawley 백서를 대조군 (8마리)과 복강 내로 streptozotocin을 투여하여 당뇨를 유발시킨 당뇨군 (8마리)으로 나누어 실험하였다. 배양 족세포와 백서 신장으로부터 분리한 사구체에서 CYP11B2와 MCR의 mRNA 및 단백 발현은 각각 real-time PCR과 Western blot을 이용하여 분석하였다. 세포 배양액 내 안지오텐신 II 농도는 ELISA를, 그리고 알도스테론 농도는 radioimmunoassay를 이용하여 측정하였다. 신장 조직을 이용한 이중 면역형광염색을 시행하여 당뇨 조건 하에서 족세포 내 CYP11B2와 MCR의 발현 변화를 관찰하였다.

결과: CYP11B와 MCR의 mRNA 및 단백 발현은 정상 포도당군에 비하여 고포도당으로 자극한 족세포군에서 유의하게 증가되었으며 (P<0.05), 안지오텐신 제 1형 수용체 차단제로 전처치한 경우 고포도당군에서의 발현 증가가 의미있게 억제되었다. 안지오텐신 II도 배양 족세포에서 CYP11B2 (P<0.05)와 MCR (P<0.01)의 mRNA 및 단백 발현을 의의있게 증가시켰다. 세포 배양액 내 안지오텐신 II 농도는 고포도당군 (2.54 0.33 pg/ l)에서 정상 포도당군(1.13 0.12 pg/μl)에 비하여 유의하게 높았다 (P<0.01). 알도스테론 농도도 고포도당군 (318.5 41.6 pg/mL)과 안지오텐신 II으로 자극한 군 (377.2 53.3 pg/mL)에서 정상 포도당군 (129.0 15.3 pg/mL)에 비하여 의미있게 높았으며 (P<0.01), 고포도당군에서 증가된 알도스테론 농도는 안지오텐신 제 1형 수용체 차단제에 의하여 의의있게 감소되었다 (P<0.05). 24시간 뇨알부민 배설량은 대조군 (0.37 0.07 mg/day)에 비하여 당뇨군 (1.69 0.30 mg/day)에서 유의하게 많았다 (P<0.05). 사구체 내 CYP11B2와 MCR의 mRNA 및 단백 발현은 당뇨군에서 대조군에 비하여 의미있게 증가되었으며, CYP11B2 및 MCR과 synaptopodin을 이용한 이중 면역형광염색을 시행한 결과, 당뇨 조건 하에서 사구체 내 CYP11B2 및 MCR 단백의 발현 증가는 주로 족세포 내에서의 증가에 기인함을 알 수 있었다.

결론: 이상의 실험 결과로 미루어 보아, 당뇨 조건 하에서 족세포 내 국소적 알도스테론계가 활성화되며, 이러한 활성화는 국소적 레닌-안지오텐신계의 활성화와 관련이 있을 것으로 생각된다. 또한, 이러한 족세포 내 국소적 알도스테론계의 활성화가 당뇨병성 신병증의 발생 및 진행과 일부 연관되어 있을 것으로 사료된다.

[영문]Background: Accumulating evidence has suggested that aldosterone plays an important role in the pathogenesis and progression of diabetic nephropathy. Besides adrenal gland, previous studies have shown that endothelial cells, vascular smooth muscle cells and the heart can also produce aldosterone, which may play a more important role in the development of vascular and myocardial fibrosis. In the kidney, glomerular mesangial cells and tubular epithelial cells were found to produce aldosterone based on the presence of aldosterone synthase (CYP11B2). However, the expression of CYP11B2 and aldosterone biosynthesis was not fully explored in podocytes. In addition, although CYP11B2 expression was found to be increased in diabetic kidney, it was not elucidated whether the glomerular cells are responsible for this increase. This study was undertaken to investigate whether a local aldosterone system is present in podocytes and whether aldosterone production and the expression of CYP11B2 and mineralocorticoid receptor (MCR) are changed in podocytes cultured under high glucose conditions. Further, the changes in CYP11B2 and MCR expression were verified in diabetic glomeruli.

Methods: In vitro, immortalized mouse podocytes were exposed to medium containing 5.6 mM glucose (NG), NG + 24.4 mM mannitol (NG+M), NG + 10-7 M Angiotensin II (NG+AII), or 30 mM glucose (HG) with or without pretreatment of angiotensin II type I receptor blocker (ARB) for 6-hours. In vivo, 16 Sprague-Dawley rats were injected either with diluent (n=8, C) or with streptozotocin (65 mg/kg) intraperitoneally (IP) (n=8, DM). CYP11B2 and MCR mRNA expression were determined by real-time PCR and their protein expression by Western blot. AII and aldosterone levels were determined by ELISA and radioimmunoassay, respectively. Double immunofluorescence staining using renal tissue were also performed to identify which glomerular cells were responsible for the changes in CYP11B2 and MCR protein expression under diabetic conditions.

Results: CYP11B2 and MCR mRNA and protein expression were significantly increased in HG-stimulated podocytes compared to NG cells (P<0.05), and these increases in HG cells were attenuated with ARB treatment. AII also induced CYP11B2 (P<0.05) and MCR mRNA and protein expression (P<0.01) in cultured podocytes. AII levels were significantly higher in HG-conditioned media (2.54?0.33 pg/?l) compared to NG-conditioned media (1.13?0.12 pg/μl) (P<0.01). Aldosterone levels were also significantly higher in NG+AII-conditioned media (377.2?53.3 pg/mL) and HG-conditioned media (318.5?41.6 pg/mL) compared to the NG medium (129.0?15.3 pg/mL) (P<0.01), and this increase of aldosterone concentrations in the HG-conditioned medium was abrogated by ARB (P<0.05). Compared to C rats (0.37?0.07 mg/day), 24-hour urinary albumin excretion was significantly higher in DM rats (1.69?0.30 mg/day, P<0.05). The changes in CYP11B2 and MCR mRNA and protein expression in DM glomeruli were similar to those in high glucose-stimulated podocytes. Double immunofluorescence staining for CYP11B2 and MCR with synaptopodin revealed that the increases in CYP11B2 and MCR protein expression in DM glomeruli were mainly attributed to their increases in podocytes.

Conclusion: CYP11B2 and MCR mRNA and protein expression were significantly increased in diabetic glomeruli and cultured podocytes under high glucose conditions along with increased aldosterone levels. The increases of CYP11B2 and MCR expression in high glucose-stimulated podocytes were ameliorated by ARB. These findings suggest that a local aldosterone system is activated in podocytes under diabetic conditions via renin-angiotensin system pathway, and its activation may play an important role in the pathogenesis of diabetic nephropathy.