탈회골기질에 의해 유도되는 인간 황색 인대 세포의 골 유도능

Abstract

[한글]황색 인대의 비후 혹은 골화에 의해 척추관 협착증이 일어 날 수 있다는 사실로 보아 인간 척추 황색 인대의 골 형성 잠재력을 간접적으로 유추할 수 있다. 최근에는 시험관 내에서 퇴행된 황색 인대 세포가 조골 세포 표현형을 자발적으로 나타낸다는 점이 입증 되었다. 탈회골기질 (demineralized bone matrix: DBM)은 골 이식 물질로 연구되고 있으며 BMP-2 (bone morphogenetic protein-2), BMP-4, BMP-7 과 같은 BMP 종류와 Transforming growth factor-beta1, platelet-derived growth factor, fibroblast growth factor, vascular endothelial growth factor 와 같은 여러 성장 인자들을 포함하는 물질이다. 탈회골기질에 함유된 고유의 성장 인자들의 생물학적인 활성은 골 유도를 위해 필수적인 요소들이다. 여러 동물 실험들을 통해 탈회골기질에 의한 골 형성 능에 대한 많은 연구가 수행되었지만 탈회골기질의 작용에 의한 황색 인대 세포의 골 형성능에 대한 자세한 연구는 아직까지 시행되지 않았다. 따라서 본 실험에서는 탈회골기질에 의한 퇴행된 황색 인대 세포의 골 형성능을 증명하고자 하였다. 퇴행되고 비후한 황색 인대는 척추관 협착증 환자로부터 외과적 척추 감압술시 채취하였다. 효소 소화법으로 황색 인대의 섬유세포-유사세포를 분리하였다. 탈회골기질은 Regeneration (RegenerationTM Technologies, INC, Alachua, FL, USA) 사의 제품을 사용하였으며, RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) 의 방법으로 collagen I, Dlx 5, osterix, Msx-2, osteocalcin 유전자의 mRNA 발현량이 측정되었고 Cyquant assay에 의한 세포 증식능 평가, alkaline phosphatase (ALP) 염색, von Kossa 염색, 동물 실험을 통한 von Kossa 염색 과 hematoxylin and eosin (H&E) 염색을 실시하였다. 탈회골기질을 투여한 조건에서 퇴행된 황색 인대 세포가 골 형성 인자인 collagen I, ALP, 미네랄 침착이 관찰되었으며 이를 ALP 와 von Kossa 염색과 RT-PCR을 통해 골 형성능을 확인 하였다. 탈회골기질은 퇴행된 황색 인대 세포에서 골 형성능을 증가시키며, 이는 탈회골기질을 통해 퇴행, 비후된 황색 인대를 척추 유합술에서 자가골의 대체물로서 이용할 수 있는 가능성을 제시하였다.

[영문]Many attempts have been made to apply demineralized bone matrix(DBM) for bone regeneration. It has been reported that DBM derived from human tissues induces bone formation and spinal fusion, and that DBM is widely used as a bone graft substitutes in orthopaedic and dental surgery. In addition, Ligamentum flavum (LF) was reported to have osteogenic potential with stimulation for bone morphogenetic protein-2 which is also included in DBM. Although many potential studies for osteogenesis by DBM have been evaluated, osteogenesis of human LF by DBM has not yet been found. In this study, we elucidated the effect of DBM on osteogenesis of human LF. Experimental group (human LF cell culture) was incubated in media solution containing 5mg/ml DBM for 3day, 7day, 14day and 28day, and control group was incubated in media which have no DBM. To assess proliferation rate, we performed Cyquant assay. To assess osteoinductivity, we performed RT-PCR of osteogenic marker gene and von Kossa, alkaline phosphatase (ALP) staining after incubating LF with DBM. DBM, LF and mixture of DBM and LF was implanted to nude mouse. After 28days, H&E, von Kossa were performed. Human LF cell cultured with DBM showed increased proliferation without cytotoxicity compared to control group. The expression of collagen type I demonstrated upregulation, but early osteogenic factors decreased. However, result of ALP and von Kossa was shown that experimental group, LF by adding the DBM, showed positive osteogenic induction compared to control group without DBM. We proved that human LF cells cultured with DBM showed increase in proliferation and upregulation of osteogenic phenotypes. Given osteogenic potential of human LF with DBM can be used for carrier for DBM and bone graft substitute in spinal surgery. The application of mixture DBM and LF will likely be useful in the clinical reconstruction of bone.