압력 저속 냉동이 쥐치아 치주인대세포에 미치는 영향

Abstract

[한글]본 연구의 목적은 흰 쥐의 상악 대구치를 발거한 후 압력 저속 냉동 보관법으로 냉동 보관한 후 MTT, WST-1 검색법과 TUNEL 검사법을 이용하여 치주인대세포의 활성도와 세포 사멸도를 다른 냉동 보관법과 비교, 측정하고자 하였다.

생후 4주된 암컷 Sprague-Dawley계 흰쥐의 상악 좌우 제 1,2 대구치를 발거하여 각 군 당 18개의 쥐 치아를 MTT, WST-1 검색에 이용하였고 6개의 치아를 TUNEL 검사에 이용하였다. 실험군은 5 개군으로 대조군은 즉시 발치군이며, 4℃ 냉장고에 일주일간 보관한 냉장군, 발치 후 동해방지제 처리과정을 거쳐 -196℃의 액화질소에 넣어 냉동한 급속 냉동군, 4℃에서 -35℃까지 -0.5℃/min 속도로 서서히 냉동시킨 뒤 -196℃에 냉동한 저속 냉동군, 3MPa의 압력을 가하고 -0.5℃/min 속도로 4℃에서 -35℃까지 서서히 냉동시킨 뒤 -196℃에 냉동한 압력 저속 냉동군으로 나누었다. 보존액은 F medium을 사용했으며 동해방지제로 10% dimethylsulfoxide(DMSO)를 사용하였다. 치근면을 단위면적으로 표준화하기 위해 MTT, WST-1 측정값을 Eosin 염색 후 530nm에서 측정한 흡광도 값으로 나누었다. TUNEL 검사 시 각 조직슬라이드에서 400배 크기의 현미경 시야에서 임의로 세 부분을 지정하여 정상 세포수와 양성 세포수를 세어 그 비율을 계산하여 각 실험군 당 평균치를 구하였다. 통계 분석을 위해 one way ANOVA를 시행하였으며 사후 검정으로는 Tukey 방법을 사용하였고 결과는 다음과 같다.

1. MTT 검색에 의한 흡광도를 Eosin 염색 후 측정한 흡광도로 나눈 값에서는 압력 저속 냉동군은 즉시 발치군보다 유의성 있게 세포 활성도가 낮았으나(p<0.05), 저속 냉동군이나 냉장군과 비교할 때는 높은 세포 활성도를 보이며 통계적 유의성이 있었다(p<0.05). 급속 냉동군과 비교할 때는 높은 세포 활성도를 보였지만, 통계적 유의성은 없었다.

2. WST-1 검색에 의한 흡광도를 Eosin 염색 후 측정한 흡광도로 나눈 값에서도 MTT 검색과 마찬가지로 압력 저속 냉동군에서는 즉시 발치군보다 유의성 있게 세포 활성도가 낮았으나(p<0.05), 저속 냉동군이나 냉장군과 비교할 때는 높은 세포 활성도를 보이며 통계적 유의성이 있었다(p<0.05). 급속 냉동군과 비교할 때는 높은 세포 활성도를 보였지만, 통계적 유의성은 없었다.

3. TUNEL 검사 결과는 모든 군들이 세포 사멸도에 있어서 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다.

[영문]The purpose of this study was to evaluate the viability of periodontal ligament cell in rat teeth using slow cryopreservation method under pressure by means of MTT assay, WST-1 assay and TUNEL test. 18 teeth per group of Sprague-Dawley white female rats of 4 week-old were used for each group.

The maxillary left and right, first and second molars were extracted as atraumatically as possible under tiletamine anesthesia. The experimental groups were group 1 (Immediately extraction), group 2 (Cold preservation at 4℃ for 1 week), group 3(Rapid freezing in liquid nitrogen), group 4(Slow freezing), group 5(Slow freezing under pressure of 3MPa). F-medium was used as preservation medium and 10% DMSO as cryoprotectant. After cryopreservation and thawing, MTT assay, WST-1 assay, TUNEL test were processed. One way ANOVA and Tukey method were performed at the 95% level of confidence. The values of optical density obtained after MTT assay and WST-1 were divided by the values of eosin staining for tissue volume standardization.

In both MTT and WST-1 assay, group 5 showed higher viability of periodontal ligament cell than group 2 and 4. but showed lower viability of periodontal ligament cell than group 1. In TUNEL test, there were no positive cells in group 4. And it showed no significant difference among group 1, 2, 3, 5.

By the results of this study, slow cryopreservation method under pressure is recommended as one of the methods for long term cryopreservation.