The effect of COX-2 inhibitor on osteogenesis in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells

Abstract

[한글]비스테로이드성 소염진통제는 arachidonic acid를 prostaglandin (PG)로 전환시키는 cyclooxygenase (COX)를 억제시켜 그 효과를 나타낸다. 이러한 COX 와 PG는 골대사에 중요한 역할을 하며, 특히 PGE2가 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. COX-2 는 골형성에 필요한 유전인자인 Runx2/Cbfa1와 osterix의 발현을 유도한다. 하지만, 지금까지 비스테로이드성 소염진통제와 같은 COX-2 억제제가 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포의 골형성 분화를 억제하는 지에 대한 실험실내 연구는 없었다.

본 연구에서는 COX-2 선택적 억제제인 Celecoxib와 비선택적 COX 억제제인 Naproxen과 같은 비스테로이드성 소염진통제에 의해 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포의 골형성 분화가 억제되는 지에 대해 분석해 보았다.

실시간 역전사 중합효소 연쇄반응 (real-time RT-PCR)에서 Celecoxib가 처리된 세포에서 단지 mPGES의 mRNA 발현이 감소된 반면 Naproxen이 처리된 세포에서는 농도에 비례하여 cPGES와 mPGES의 발현이 감소되었다. 그러나, COX-1과 COX-2의 발현에는 영향이 없었다. IL-1β (1 ng/ml)은 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포에서 COX-2와 mPGES의 발현과 골형성 분화를 유도하였다. 반면 세포에 IL-1β와 Celecoxib 혹은 Naproxen을 처리한 경우 농도-의존적으로 골형성 분화를 감소시켰다. 고농도의 비스테로이드성 소염진통제 (40 μM Celecoxib and 300 μM Naproxen)로 처리된 세포에서는 alkaline phosphatase (ALP)의 발현과 칼슘 침착 정도가 의미있게 저해되었다. 고농도의 비스테로이드성 소염진통제로 처리된 세포에서 골형성 분화의 저해는 감소된 cPGES 혹은 mPGES와 관련이 있을 것이다. 일반적으로 치료 적정 농도라고 알려진 10 μM Celecoxib와 100 μM Naproxen에서는 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포의 골형성 분화의 억제 효과가 없었다. 하지만, 치료 적정 농도보다 높은 고농도의 20, 40 μM의 Celecoxib와 200, 300 μM의 Naproxen 골형성 분화를 심각하게 억제하였다.

IL-1β가 처리된 염증성 조건의 중간엽 줄기 세포의 골형성 분화 초기에 Runx2/Cbfa1 발현이 증가되었고, osterix 발현은 분화 후기에 증가하였다. 그리하여 분화 초기에 ALP의 발현이 증가되었고, Celecoxib와 Naproxen에 의해 농도 의존적으로 감소하였다. 이러한 결과들은 골절과 같은 염증성 환경에서의 골 치유가 정상 골형성시 일어나는 기전과는 다른 기전에 의해 일어난다고 할 수 있다. 따라서, 염증성 조건하의 중간엽 줄기세포에서 의 처리는 골형성 분화에 필요한 유전인자의 발현을 억제시켜 골 치유에 심각한 억제 효과를 나타낼 수 있다. 그러므로 이러한 고농도 비스테로이드성 소염진통제의 골형성 분화에 대한 억제 효과로 인해, 고용량의 비스테로이드성 소염진통제를 복용시에는 주의를 요한다.

[영문]Non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) exert their effects by suppressing cyclooxygenase (COX) enzymes, which convert arachidonic acid to prostaglandins (PGs). COX enzymes and PGs have been shown to play important roles in bone metabolism. It is generally accepted that prostaglandin E2 (PGE2) is the most important PG in bone formation and resorption. In addition to bone resorption, COX-2 has also been shown to have a role in bone formation by increasing the expression of core-binding factor a1 (Runx2/Cbfa1) and osterix, the two genes required for bone formation. However, until now, no in vitro study has been conducted on whether COX inhibitors such as NSAIDs suppress the osteogenic differentiation of human bone marrow cells. The purpose of this study is to identify whether the osteogenesis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs) is inhibited by NSAIDs such as the COX-2 inhibitor, Celecoxib, and the non-selective COX inhibitor, Naproxen.

The mRNA levels of membrane-associated PGE synthase (mPGES) were reduced in the Celecoxib-treated cells, suggesting that mPGES, a downstream molecule of COX-2, was selectively inhibited by Celecoxib. In contrast, both cytosolic PGES (cPGES) and mPGES were reduced in a dose-dependent manner in the cells treated with Naproxen. The expression of COX-1 and COX-2 was not changed in the cells treated with Celecoxib and Naproxen. Human recombinant IL-1β (1 ng/ml) induced the expression of COX-2 and mPGES and osteogenesis in hMSCs, whereas a combination of IL-1β and either Celecoxib or Naproxen decreased osteogenesis. The inhibitory effects of the two NSAIDs on osteogenesis were dose-dependent, and alkaline phosphatase (ALP) expression and calcium mineral deposition were significantly inhibited in the cells treated with high-dose NSAIDs (40 μM Celecoxib and 300 μM Naproxen). The inhibition of osteogenesis in hMSCs by high doses of NSAIDs may be correlated with decreased PGES, suggesting that cPGES and/or mPGES are involved in bone formation. The osteogenesis of hMSCs was not affected by therapeutic doses of 10 μM Celecoxib and 100 μM Naproxen, of which the concentration is generally used in in vitro experiments. However, 20 and 40 μM Celecoxib and 200 and 300 μM Naproxen (over-therapeutic doses) significantly inhibited osteogenic differentiation.

The expression of Runx2/Cbfa1 was increased by pretreatment of IL-1β during the early stage of osteogenesis in inflammatory-conditioned hMSCs, and the expression of osterix was increased during the late stage. The expression of ALP increased during the early stage of osteogenesis, and the increased expression of ALP was reduced in a dose-dependent manner by the two NSAIDs. These results suggest that bone healing under inflammatory conditions after fracture is achieved by different pathways than the one taken during normal bone formation. NSAID treatments at over-therapeutic doses in inflammatory-conditioned osteogenic hMSCs may have serious inhibitory effects on bone healing by suppressing the gene expression of transcription factors essential for osteogenesis. Therefore, the negative effects of NSAIDs on osteogenesis in hMSCs must be considered when prescribing high or greater than therapeutic doses of NSAIDs.