Conjugation of hyaluronic acid with ascorbic acid and evaluation of its in vitro activity on MC3T3-E1

Abstract

[한글]골 이식재로 최근 많이 사용되는 히아루론산은 조직의 수화작용 및 구조 유지, 세포의 발달 및 운동성에 있어 중요한 역할을 하며, 생체적합성이 뛰어나고 hyaluronidase에 의하여 생분해 되어 생체 친화적이라는 이점을 가지고 있다. 아스코르브산은 골 세포의 분화 및 증식 작용에 있어 필수적인 성장요소이나 빛과 열에 약하다는 단점을 가지고 있다.

본 연구에서는 골이식재를 위한 히아루론산에 아스코르브산을 접합하여 히아루론산 지지체에 본래의 기능에 아스코르브산의 활성을 더하여 조골세포의 좀 더 높은 활성을 가진 골 이식재를 만들고자 하며, in vitro 상에서 이 복합체가 각각의 순 물질보다 활성 및 물질의 안정성이 더 뛰어남을 보이고자 한다.

히아루론산과 아스코르브산의 접합을 위해선 N- hydroxysuccinimide (NHS)를 사용하여 두 단계의 반응으로 좀 더 접합이 잘 일어나도록 하였으며, 접합한 복합체는 투석 과정을 통하여 정제하였다. 접합 과정에서 pH 및 히아루론산, 아스코르브산의 비율을 달리하여 높은 수율의 접합이 일어나는 조건을 찾도록 하였고, GPC 분석으로 확인하였다. 생성된 복합체는 미 분화 조골세포인 MC3T3-E1을 이용하여 생체 적합성 시험(세포 생존도 및 증식시험)과 활성시험(Type ? collagen 과 Alkaline phosphatase의 발현 정도 확인), 뼈의 미네랄 침착시험을 알리자린 레드 염색과 본 코사 염색으로 칼슘의 침착을 확인하였다.

이를 바탕으로 접합된 히아루론산과 아스코르브산 유도체는 골 이식을 위한 높은 활성도를 보였으며 이를 근거로 향후 연구를 전망해 보고자 한다.

[영문]Hyaluronic acid (Hyalronan, HA), β-1,4-linked D-glucuronic acid and β-1,3 N-acetyl-D-glucosamine polysaccharide, is a nonsulfated glycosaminoglycan (GAG) conserved in extracellular matrix (ECM). Due to its biocompatibility, biodegradable properties, HA is widely applied for tissue engineering. However, HA also has defects for tissue engineering such as mechanical properties, difficulty of handling. Thus, it is variously modified by chemical reactions to produce HA derivative. HA plays an important role in tissue morphogenesis, proliferation and cell differentiation. Ascorbic acid (AA) has an effect on collagen synthesis and bone mineralization. Ascorbate levels also have a significant effect on osteoblast proliferation and alkaline phosphatase (ALP) expression. However, AA is weak to heat and light, thus it is easily degradable. Therefore, we conjugated HA with AA in order to make it more stable and effective. In this study, we prepared HA-AA conjugate and evaluated activity of products in pre-osteoblast.

To produce more effective conjugation, we synthesized HA derivative, HA-N-hydroxysuccinimide, an activated ester of the glucuronic acid moiety. This HA-active ester intermediate is a precursor for drug-polymer conjugates. The degree of substitution was calculated by NMR analysis. The modified HA was dialyzed and lyophilized. The yield of conjugation is calculated by Gel Permeation Chromatography (GPC). After the process, HA was conjugated with AA once again as previously mentioned. In this study, the resultant HA-AA conjugate was tested on MC3T3-E1, murine pre-osteoblast cells. We examined cellular viability (cytotoxicity), proliferation and type Ι collagen expression. The expression of Type ? collagen was examined by sirius red staining, ELISA assay kit and western blot. Alkaline phosphatase assay was also performed. For confirmation on bone mineralization, alizarin red staining and von Kossa staining was performed.

In conclusion, the in vitro data demonstrate that HA-AA conjugate has an important role in bone formation, as it can increase proliferation and osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells. These observations further support its use in in vivo system for tissue engineering applications.