Effects of ranolazine on norepinephrine-induced cell death through inhibition of β-adrenoceptor signal pathway in cardiomyocytes

Abstract

[한글]라놀라진은 칼슘과부하가 유도되어 생기는 지속적인 나트륨 유동을 특이적으로 저해하는 것으로 알려져 항 협심증 치료제로 대두되고 있지만, 라놀라진의 지속적인 나트륨 유동 저해 메커니즘이 명백하게 밝혀지진 않았다. 베타 아드레날린 수용체가 심근세포에서 심장기능 조절에 중요한 역할을 하는 것을 바탕으로 노르에피네프린을 처리하여 베타 아드레날린 수용체를 자극한 심근세포에서 라놀라진이 대표적인 베타 아드레날린 수용체 길항제인 프로프라노롤과 유사한 반응이 나타날 것으로 기대했다. 따라서, 본 연구에서는 베타 아드레날린 수용체를 자극하는 노르에피네프린을 통해 지속적 나트륨 유동, 칼슘 과부하, 세포사멸이 유도된 심근세포에서 라놀라진의 베타 아드레날린 수용체 길항제 활성을 조사하기 위해 2 μM 프로프라노롤, 3 μM 라놀라진 그리고 프로프라노롤과 라놀라진을 함께 처리한 심근세포에 24시간 동안 10 μM 노르에피네프린을 처리하였다. 라놀라진은 노르에피네프린에 의해 유도되어 증가된 세포 내 칼슘과 나트륨 농도를 각각 40±3%, 17±0.5% 감소 시켰고, 노르에피네프린 자극세포에서 라놀라진이 베타 아드레날린 수용체 신호기전에서 나트륨 채널을 조절하는 것으로 알려진 CaMKII (Ca2+/calmodulin dependent protein kinase II) 발현을 57±2% 감소시켰으며, 칼슘 관련인자인 L-Type Ca2+ channel, phspholamban, SERCA2a의 발현을 각각 48±3.5%, 45±2%, 36±0.5% 증가하였으며, Na+-Ca2+ exchanger, ryanodine receptor2의 발현을 각각 21±0.5%, 47±1.5% 감소하여 노르에피네프린에 의한 라놀라진 효과가 확인되었다. 마지막으로, annexin V/PI staining을 통하여 apoptosis를 분석한 결과 라놀라진 처리한 군이 노르에피네프린만 처리한 군에 비해 39±1.5% 감소하였으며, 전사멸인자인 Bax, 항사멸인자인 Bcl-2, 그리고 cytochrome C의 단백질발현이 2배 이상 저해된 것을 확인함으로 인해 라놀라진의 세포사멸 억제효과를 증명하였다. 이상의 결과로 라놀라진이 노르에피네프린에 의해 유도된 베타 아드레날린 수용체 신호기전에 영향을 줌으로 써 심장기능 이상을 완화시키는 것이 증명되었다.

[영문]Ranolazine has been represented a new agent of antianginal therapy with mechanisms of action that blocked intracellular sodium and calcium overload accompanying myocardial ischemia. However, effect of ranolazine on β-adrenoceptor signal transduction system is poorly understood. This study was designed to confirm whether mechanism has related to β-adrenoceptor antagonist activity of ranolazine on norepinephrine (NE)-induced cardiomyocytes. After cardiomyocytes were preincubated with propranolol (2 μM), ranolazine (3 μM) and mixture of propranolol and ranolazine, cardiomyoxytes were treated with NE (10 μM) for 24 h. The phosphorylation of ERK was decreased about 52±2.5% by ranolazine treatment more than NE only treated cells. The intracellular Ca2+ and Na+ level were decreased about 40±3% and 17±0.5%, respectively. Ranolazine decreased expression level of the Ca2+/calmodulin dependent protein kinaseII (CaMKII, 57±4%), Na+-Ca2+ exchanger (NCX, 21±0.5%) and ryanodine receptor2 (RyR2, 47±1.5%) compared with NE only treated cardiomyocytes. Ranolazine also increased expression level of L-type Ca2+ channel (LTCC, 48±3.5%), phospholamban (PLB, 45±2%) and sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase 2a (SERCA2a, 36±0.5%) in NE only stimulated cardiomyocytes, respectively. The number of annexin V/PI positive cell was decreased about 39±1.5% by ranolazine compared with NE only treated cardiomyotes. Ranolazine also inhibited apoptosis through the regulation of pro-apoptotic factor Bax, anti-apoptotic factor Bcl-2 and cytochrome C release. These results demonstrate that ranolazine had an effect on norepinephrine-induced cell death through inhibition of β-adrenoceptor signal pathway in cardiomyocytes.