계면활성제를 첨가한 잔토리졸(xanthorrhizol)의 항균효과

Abstract

[한글]본 연구에서는 Curcuma xanthorrhiza에서 추출한 난용성 항균물질인 잔토리졸을 가용화 시키기 위한 방법으로 수종의 계면활성제를 탐색하고 적정 조성 비율을 결정하고자 하였다. 또한 최근 개발된 바이오필름모델(biofilm model)에 적용하여 가용화된 잔토리졸의 항균능력을 평가하고 세포에 대한 독성평가를 시행하여 실제 구강환경에 대한 적용 가능성을 알아보고자 하였다.

잔토리졸을 가용화 시키기 위해 에탄올과 계면활성제를 각 농도별로 제조하여 각기 다른 농도로 잔토리졸과 혼합하였다. 가용화 여부를 평가하기 위해 2×107 S. mutans에 각 조제 용액을 처리하여 항균력이 있는 적정 조성 비율을 결정하였다. 항균력이 있는 배합 용액을 선택하여 S. mutans 바이오필름에 대한 항균력을 측정하고자 하였다. 이를 위해 수산화 아파타이트 디스크 위에 인공 S. mutans 바이오필름을 형성하여 선택한 용액을 처리하였다. 또한 선택한 용액의 세포에 대한 독성을 평가하기 위해 L929 세포에 선택 용액을 처리한 후 MTT 시약을 이용하여 세포 독성 평가를 시행하였다.

난용성 항균물질인 잔토리졸이 유기용매로 사용한 에탄올과 SLS, sarcosinate, taurate 각각의 계면활성제를 혼합한 용액에서 얼마나 가용화되는지의 여부를 항균력을 통해 알아보았다. 0.01% SLS에서는 물리적인 힘을 가한 후 균을 접종시킬 경우 효과가 나타났지만 하루 경과한 경우 효과가 떨어지는 것으로 나타났다(p<0.00). 0.015% SLS에서는 0.01% SLS의 농도보다 항균효과가 더 컸으며 하루 경과한 경우에도 0.01% SLS의 농도보다 항균효과가 크게 떨어지지는 않는 것으로 나타났다(p=0.022). 또한 에탄올의 농도가 높아질수록 그 효과는 더 컸으며 0.02%의 농도부터는 항균효과가 거의 같게 나타났으며 유기용매인 에탄올의 농도에도 크게 영향을 받지 않는 것으로 나타났다(p=0.041).

Sarcosinate는 물리적인 힘을 가한 후 바로 균을 접종시킬 경우 0.025%의 농도에서 유기용매의 농도와 상관없이 항균력이 나타났으나 하루 경과한 경우 항균력이 급격하게 감소되었다(p=0.003). 하루가 경과한 후에도 항균력을 잃지 않은 sarcosinate의 농도는 0.04%부터였다.

Taurate의 경우 0.025%의 농도에서 항균효과가 나타났으며 이는 물리적 힘이 가해진 경우나 하루 경과한 경우에 따른 차이가 크지 않았다. 또한 에탄올의 농도가 증가함에 따라 항균력이 증가하였다.

잔토리졸의 함량에 따라 계면활성제와 에탄올 혼합물의 항균력이 증가하는지 알아보고자 하였다. 모든 경우 12.5 ppm 보다 25 ppm의 경우 그래프의 기울기가 더 경사지게 났으며 이는 곧 25 ppm의 경우 항균력이 더 뛰어나다는 것을 나타낸다.

각 플랑크토닉 상태의 균에 항균효과가 가장 뛰어난 혼합용액을 선택하여 인공 S. mutans 바이오필름에 적용하여 항균효과를 알아보았다. 그 결과 0.025% SLS, 0.035% sarcosinate, 0.03% taurate 각각의 계면활성제에 12.5% 에탄올과 25 ppm 잔토리졸을 혼합한 용액에서 바이오필름 형성을 억제하는 효과가 나타났다. 그 중에서도 특히 SLS와 taurate의 효과가 큰 것을 알 수 있었다.

잔토리졸을 에탄올에 용해시키지 않고 계면활성제만으로 용해되는지의 여부를 항균효과를 통해 알아보았다. 그 결과 0.02% SLS와 0.035% sarcosinate 각각의 계면활성제에 12.5 ppm, 25 ppm 잔토리졸 각각을 혼합한 경우 항균효과가 나타났으나 0.035% taurate와 12.5 ppm, 25 ppm 잔토리졸 각각을 혼합한 경우에는 항균효과가 나타나지 않았다.

미생물에 항균력이 있는 혼합용액이 세포독성을 나타내는지 확인하였다. 그 결과 SLS 0.02% + 잔토리졸 12.5 ppm + 에탄올 1.5625%, taurate 0.025% + 잔토리졸 12.5 ppm + 에탄올 6.25%, sarcosinate 0.035% + 잔토리졸 25 ppm + 에탄올 12.5% 혼합용액의 세포독성은 클로르헥시딘과 같으므로 안전성이 있는 것으로 나타났다.

연구 결과 잔토리졸은 에탄올과 계면활성제의 적절한 조합으로 가용화될 수 있었다. 가용화된 잔토리졸은 구강 내 효능을 실제 임상에 적용하기 전에 구강환경과 유사한 바이오필름 모델에서 바이오필름 억제효과가 나타났으며 세포에 대한 독성도 클로르헥시딘과 같았다. 따라서 천연물인 잔토리졸을 가용화함으로써 기존의 화학적 항균제의 부작용을 최소화할 수 있을 것이고 유아나 전신질환을 갖고 있는 환자의 구강관리에 효과적으로 사용될 수 것으로 생각된다.

[영문]The purpose of this study was to determine proper sort and concentration of surfactants for solubilization of xanthorrhizol. Also antibacterial effect of solubilized xanthorrhizol using recently developed biofilm model and cytotoxicity for clinical application were tested.

To solubilize xanthorrhizol, ethanol and surfactant at different concentration were mixed. As antibacterial effect of xanthorrhizol correspond to solubilization of xanthorrhizol, suspensions of S. mutans cells at the same concentration (2×107 cells/ml) and test solutions were mixed to test antibacterial effect. A artificial S. mutans biofilms were made on hydroxyapatite disc to evaluate inhibition effect of test solution in antibacterial effect on biofilm. The artificial biofilms were treated by test solutions in antibacterial effect. For effect of test solutions on cytotoxicity, L929 cell was treated by test solutions and MTT solution.

Solubilization of xanthorrhizol in ethanol and surfactant; SLS, sarcosinate, taurate was assessed as antibacterial activity. 0.01% SLS had antibacterial effect immediately after vortexing (p<0.00). Antibacterial effect of 0.015% SLS was higher than 0.01% SLS. The more ethanol concentration was increased, the more antibacterial effect was increased. 0.02% SLS independent from the ethanol concentration had antibacterial effect immediately after vortexing and after a day (p=0.041).

0.025% Sarcosinate independent from the ethanol concentration had antibacterial effect immediately after vortexing but after a day (p=0.003). 0.04% Sarcosinate had antibacterial effect after a day.

0.025% Taurate had antibacterial effect immediately after vortexing and after a day. The more ethanol concentration was increased, the more antibacterial effect was increased.

Increase of antibacterial effect with xanthorrhizol concentration was determined. 25 ppm xanthorrhizol was higher than 12.5 ppm xanthorrhizol.

Xanthorrhizol mixture that have the most antibacterial effect on planktonic bacteria was selected and antibiofilm effect on artificial S. mutans biofilm was assayed. 0.025% SLS+12.5% ethanol+25 ppm xanthorrhizol, 0.035% sarcosinate+12.5% ethanol+25 ppm xanthorrhizol, 0.03% taurate+12.5% ethanol+25 ppm xanthorrhizol had inhibition effect on biofilm formation. Inhibition effect of SLS and taurate on biofilm formation was higher than sarcosinate.

Solubilization of xanthorrhizol in surfactant without ethanol was tested as antibacterial activity. 0.02% SLS+12.5 ppm xanthorrhizol, 0.02% SLS+25 ppm xanthorrhizol, 0.035% sarcosinate+12.5 ppm xanthorrhizol, 0.035% sarcosinate+25 ppm xanthorrhizol had antibacterial effect.

Cytotoxicity of xanthorrhizol mixture that have antibacterial effect was assessed. There was no significant difference between 0.02% SLS+12.5 ppm xanthorrhizol+1.5625% ethanol, 0.025% taurate+12.5 ppm xanthorrhizol+ 6.25% ethanol, 0.035% sarcosinate+25 ppm xanthorrhizol+12.5% ethanol and 0.1% chlorhexidine in cytotoxicity.

Xanthorrhizol in proper concentration of ethanol and surfactant was soluble. Solublized xanthorrhizol had inhibition effect on artificial biofilm formation. There was no significant difference between xanthorrhizol mixture and chlorhexidine in cytotoxicity. Solublized xanthorrhizol will minimize side effect of other oral rinse. Also xanthorrhizol was considered for oral hygiene care of children and patient with systematic disease.