The protective Effects of Epigallocatechin Gallate (EGCG) against ischemia/reperfusion injury in the mouse hepatocyte

Abstract

[한글]

활성화 산소는 허혈/재관류 손상에 있어서 주된 병인으로 알려져 있다. 최근 들어 녹차 (green tea) polyphenol 이 신장과 심장 조직에서 허혈/재관류 손상을 방지할 수 있음이 밝혀졌다. 녹차는 주로 polyphenol(catechin) 으로 구성되어 있으며 이는 녹차 건조 중량의 약 40%에 해당한다. 이런 polyphenol 들 중에 epigallocatechin gallate (EGCG) 는 가장 강력한 항산화 작용을 하며 가장 많은 연구가 된 물질이다.

하지만 간세포에 대해서는 이러한 EGCG의 보호 작용에 대한 연구가 활발하지 못하다. 본 연구에서는 백서의 간장세포에 대해 활성화 산소가 줄 수 있는 손상으로부터 EGCG 가 보호작용이 있는 지를 알아보고자 한다.

백서의 간장세포를 5% fetal bovine serum 이 포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium 에서 배양한다. 그 후 세포독성이 없는 EGCG의 최대농도를 희석 실험 방법을 통해 밝혀낸다. 희석 실험 방법에는 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 and 1.0 mM of EGCG 를 이용하였다. EGCG를 24시간 처리한후 MTT assay 를 이용하여 세포의 생장능(viability)를 측정하였다. 산화적 스트레스는 두가지 방법을 이용하여 유발하였다. (1) H2O2의 첨가 (2) 250 μM 의 xanthine 과 xanthine oxidase 를 처리하였다. 산화적 스트레스의 적절한 정도를 알아보기 위하여 20mM, 10mM, 1mM, 0.1mM 의 H2O2 로 각각 24 시간 처치 후 백서 간장세포의 현미경적 검사 및 생장능을 확인하였다. 이와 마찬가지로 10U/L, 1U/L, 0.1 U/L 의 xanthine oxidase 를 250 μM 의 xanthine 존재하여 각각 처치하였다. 역시 24시간 후에 현미경적 검사 및 생장능을 확인하였다. EGCG가 산화적 스트레스로부터 백서 간장세포를 보호하는 작용을 규명하기 위하여 0.2mM 의 EGCG로 1시간과 24시간동안 각각 처리하였다. 그 후 H2O2와 xanthine oxidase 로 산화적 스트레스를 유발하고 EGCG를 전 처치 하지 않은 세포들과 생장능을 비교하였다.

H2O2와 xanthine 은 백서의 간장세포에서 산화적 스트레스에 의한 뚜렷한 생장능의 저하를 보여주었다. 현미경적 검사에서도 두 산화제에 의한 세포의 괴사와 형태변화가 뚜렷이 관찰되었다. H2O2 에 의한 산화적 스트레스는 0.2mM 의 EGCG를 1시간 또는 24시간 전처치함으로서 대부분 방지될 수 있었다. 또한 xanthine oxidase에 의한 산화적 스트레스 역시 EGCG의 전처치를 통해서 백서 간장세포의 생존능을 유지 할 수 있었다. 그러나 두 산화적 스트레스 모두에서 1시간 EGCG 전처치군과 24시간 EGCG 전처치 군에서 세포 보호 효과의 차이는 나타나지 않았다.

본 실험의 결과로 EGCG의 백서 간장세포를 산화적 스트레스로부터 보호하는 작용이 명백해졌으며 이는 추후 생체 간이식시에 항산화제로서 EGCG를 사용할 수 있는 가능성을 제시하고 있다.

[영문]

Reactive oxygen species have been implicated in the pathogenesis of hepatic injury after ischemia/reperfusion (I/R). Recently, green tea polyphenol (GTP) has been found to protect the myocardium and kidney cells against I/R injury. Green tea consists mainly of polyphenols (catechins) which constitute about 40% of the dry weight of solids in brewed green tea, of which (?)-epigallocatechin gallate (EGCG) is the most abundant and the most extensively studied catechin.

Less attention, however, has been paid to the protective effects of EGCG with respect to hepatocytes. This study was designed to investigate the potential protective roles played by EGCG against the injurious effects of reactive oxygen species in mouse hepatocytes.

Mouse hepatocytes were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 5% fetal bovine serum. Then to determine the maximal concentration of EGCG without cellular toxicity, dilution test was used. In dilution test, mouse hepatocytes were treated with 0.2, 0.4, 0.6, 0.8and 1.0 mM of EGCG. After 24 hours of EGCG treatment, the viability of the hepatocytes was assessed by MTT assay. The oxidative stress was induced by two exogenous methods: (1) H2O2 addition and (2) an enzymatic system, xanthine oxidase (XO) and its substrate xanthine (Xn, 250 μM). To determine an adequate amount of oxidative stress, different concentrations of H2O2 (20, 10, 1, 0.1 mM) were added to mouse hepatocyte. After 24 hours of incubation, the cell viability and morphology were respectively measured. Similarly, different concentrations of xanthine oxidase (10, 1, 0.1 U/L) were added to mouse hepatocyte. After 24 hours of incubation, the cell viability and morphology were measured. In order to examine the ability of EGCG to protect the mouse hepatocytes against ROS-mediated oxidative stress, the cells were pre-incubated for 1 h and 24 h in the presence of EGCG at a final concentration of 0.2mM in the medium, which was added to the cell suspension. After the oxidative stress was induced by H2O2 or XO, the cell viability and morphology were evaluated.

Oxidative stress by H2O2,, xanthine+ XO treatments causeed a significant reduction in viability of mouse hepatocytes. In the microscopic observations, the morphological changes and necrotic detachment were appreciably induced by both treatments. The H2O2-induced alterations were near completely prevented by pre-incubating the mouse hepatocyte with 0.2 mM EGCG for 1 h and 24 h (p<0.05). When the oxidative stress was induced by XO, the XO-induced alterations were also prevented by pre-incubating the mouse hepatocyte with 0.2 mM EGCG for 1 h and 24 h (p<0.05). But no significant difference was observered between 1hr EGCG treatment group and 24hr EGCG treatment group.

The results of this study suggest that EGCG can reduce hepatocyte cellular injury by preventing the oxidative stress dependent injuries on I/R and may be used in liver transplantation as an antioxidant.