Retinoic acid induces abnormal palate during rat embryogenesis : focusing on Hox gene and apoptosis

Abstract

[한글]

백서에서 구개발생은 발생 13일에서 17일 사이에 구개 돌기가 발생되고 융합된다. 발생 14일째에 입천장 선반이 아래쪽으로 자라기 시작하고 15일째에는 혀 양쪽 아래쪽으로 입천장 선반이 자라고 16일째에는 아래쪽으로 자라던 입천장선반이 혀 위쪽으로 이동하여 수평을 이루게 되고 중앙을 중심으로 입천장 선반의 가운데 부분부터 접근, 병합을 시작하며 17일째가 되면 앞뒤부분까지 융합이 완료된 완전한 구개가 형성된다. 구개열은 1000명중 1, 2명의 비율로 일어나는 매우 흔한 선천성 안면기형이다. 레티노산은 비타민 A의 내인성 대사산물로서 동물의 발생 과정 동안 정상적인 형태형성을 하기 위해 필요한 물질로 알려져 있다. 그리고 피부의 여드름 등을 치료하는 데에 많이 쓰이는데, 임신 초기에 레티노산에 과도하게 노출되거나 부족하면 구개열을 포함한 두개안면기형, 흉선 무형성, 심장유출로 결손증, 신경관 결손 등의 기형을 갖는 아이가 생긴다는 보고가 있다. 내인성 레티노산은 입천장선반의 병합시 중앙가장자리상피 세포의 세포사멸에 중요한 역할을 하지만, 외부에서 주입되거나 과도한 레티노산은 강력한 기형유발물질로 작용할 수 있는 것으로 알려져 있다. 배자 발생 과정 중 특정 시간에 그리고 배자의 특정한 위치에서 발현하여 배자의 형태를 형성하는데 관여한다고 알려져 있는 전사조절인자인 Hox유전자는 RA와 전구물질인 레티노이드의 영향을 받아 배자 발생에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 특히, Hoxa7유전자의 ectopic expression은 구개열을 포함한 안면기형이 일어나는 형태적 변화를 유도하였으며 이는 RA에 노출된 배자의 형태와 유사하다는 보고가 있었다.

본 연구에서는 백서를 이용하여 두개안면형성이 일어나는 발생 초기(E11)에 RA(100 mg/kg)를 주입한 다음 각 단계의 배자를 분리하여 구개열의 형성과정을 형태학적으로 비교 분석하였고, 특히 입천장 선반이 올라오는 시기인 E15에 구개 조직을 RA가 처리된 배지에 배양하여 in vitro 상에서도 레티노산이 구개발생에 특이적으로 영향을 미치는지 알아보았다. 또 구개 발생 과정 중 각 시기 별로 얻은 구개 조직에서 추출한 총 RNA를 이용하여 Hoxa7이 구개조직에서 발현하는지 알아보았고, 세포사멸 관련 유전자인 Bax의 발현의 변화를 확인하였다. 또한 구개 발생의 후기인 E15에 레티노산을 주입한 다음 16, 17일의 배자를 분리하여 형태를 확인하고, Hoxa7 단백질 특이적인 항체를 이용하여 면역조직화학염색을 수행하였으며, 세포사멸의 패턴을 분석하기 위해 TUNEL assay를 수행하였다.

레티노산에 노출된 배자의 경우 구개 발생 초기와 구개 발생 후기 모두에서 머리 발생 지연을 포함하여 구개열이 형성되었으며, 구순열의 경우에는 구개발생 초기에 RA에 노출된 경우에만 관찰되었다. 입천장 선반을 가지고 in vitro organ culture를 수행한 결과 RA는 구개형성에 있어서 직접적으로 기형유발 물질로 작용함을 확인하였다. 안면 발생 초기(E11)에 레티노산을 주입한 경우, Hoxa7의 발현은 정상 구개 조직에서는 발생 15일째부터 발현이 증가되어 구개형성이 끝나는 17일까지 유지되었으나, 레티노산에 노출된 구개조직에서는 15일째가 되어도 증가되지 않았다. 구개 발생 후기(E15)에 레티노산을 주입한 경우, 입천장 선반이 접촉, 병합되는 시기에 Hoxa7의 발현은 대조군에 비해 약하게 발현하였다. 구개 발생 초기에 레티노산을 주입하여 세포사멸에 관여하는 pro-apoptotic한 유전자인 Bax의 발현양상을 보면 대조군에서는 13일에서 17일까지 전체적으로 강하게 발현하는 반면, 레티노산 처리군은 발생 16일부터 급격히 줄어들었다. 구개 발생 후기(E15)에 레티노산을 주입하여, 16일과 17일의 구개 조직을 이용하여 TUNEL assay를 한 결과, 대조군은 MEE가 접촉하는 시기인 16일째에는 MES가 형성되는 부위와 구강과 비강 쪽의 상피세포에서 주로 TUNEL 양성 세포가 관찰되었고, 병합이 마무리되는 17일에는 MES가 완전히 병합되는 부위에서 TUNEL양성 세포가 관찰되었다. 반면 레티노산 처리군은 16일에 중간엽 세포쪽에서 TUNEL 양성 세포가 관찰되고 17일에는 입천장 선반의 상피세포 근처에 주로 TUNEL 양성 세포가 관찰되었다.

이상의 결과로 미루어 볼 때, 구개 발생 과정 중에 레티노산에 노출될 경우 구개열을 포함한 안면기형을 유발하며, 레티노산은 Hoxa7유전자와 세포사멸을 조절하여 기형을 유발하는 것으로 유추된다.

[영문]

The process of palatogenesis is mostly similar in rat and human. In rats, palatal process occurs between gestation day of 13 and 17. Palatal shelves start to grow on the gestation day of 14 and 15 with the downward movement. During gestation day of 16, palatal shelves move upward above the tongue and maintain in horizontal position. At the end of 16th day palatal shelves centered around and contact each other, and then complete palate is formed by gestation day of 17.

Cleft palate is the most widespread congenital facial deformity occurring in 1 or 2 human beings out of 1,000. All-trans retinoic acid (RA) is an endogenous metabolite of vitamin A, which is known to be a necessary substance for normal embryonic development. It is widely used for the treatment of pimple and other skin infections etc. It has been reported that excessive or insufficient RA causes craniofacial malformation, thymic non-formation, heart outflow tract defect and neural tube defect including cleft palate at the early stage of pregnancy. Endogenous RA plays an important role in apoptosis of medial edge epithelium during fusion of palatal shelves. Several reports suggested that exogenous and/or excess RA can act as a strong deformity causing substance.

Hox genes encode transcription factors that are known to be involved in formation of embryo by expressing at the particular time and particular region during embryogenesis. It is known to affect embryogenesis under the influence by RA and retinoid, a precursor. When Hoxa7 was expressed ectopically, morphological changes including cleft palate were detected in head region. Furthermore, this change was similar to that of embryo exposed to RA during pregnancy.

In this study, we compared and analyzed the process of formation of cleft palate by morphological observations in the embryos at different stages after injecting RA during early stage of development (E11) and collected the embryos from 13th to 17th day. We also examined the effect of RA on in vitro cultured palatal tissues (E15.5) to know the in vitro effect of RA. We performed molecular studies related to Hoxa7 and apoptosis related gene expression during RA treatment from 13th day (embryonic day 13; E13) of development to the 17th day. We also see the effect of RA by injecting the late stage of palatogenesis (E15) and collected the embryos on 16th and 17th days. We also performed the immunohistochemistry on the same samples using Hoxa7 antibody and TUNEL assay to know the apoptosis in control and RA treated samples.

In the case of embryo exposed to RA, at early stage and late stage of palate development, cleft palate was formed including head development delay, and cleft lip was discovered only when the embryo was exposed to RA at early stage of palate development. As a result of in vitro organ culture, RA was confirmed to act directly as deformity causing substance in the formation of palate. In case RA is infused at early stage (E11) of craniofacial development, expression of Hoxa7 increased from development 15th day in normal palate tissues, remaining constant until the 17th day when palate formation ends, however in palate tissues exposed to RA, no increase was made even on the 15th day. In case RA is infused in late stage (E15) of palate development, Hoxa7 expression was weak compared to control group in period of fusion. When RA is infused at early stage of palate development, expression of Bax, a pro-apoptotic gene was strong overall from the 13th day to the 17th day, however the expression of RA treatment group showed dramatic decrease from development 16th day. When RA is infused at late stage (E15) of palate development, TUNEL positive cells were observed mostly at epithelium on the side of nasal cavity and oral cavity which form rugae with parts where MEE contact occurs and medial epithelial seam (MES) occurs, and on 17th day when palatal incorporation is nearly reached, TUNEL positive cell was observed at parts where MES disappears. On the other hand, in the case of RA treatment group, it was observed that on 16th day TUNEL positive cells are distributed around the mesenchymal cell and epithelial cell of palatal shelves, and on 17th day they are distributed to parts immediately below palatal shelves epithelial cell.

These results altogether indicate that exposure to RA during palate development process causes facial deformity including cleft palate and cleft lip by modulating the expression of Hoxa7 as well as an apoptosis-related gene, Bax, and thus malregulating the apoptosis during palatogenesis.