암세포와 섬유모세포의 상호 작용 분석

Abstract

[한글]

암 발생 이후, 기저막의 파괴를 진행함과 동시에 조직 내로 침윤을 시작하며 기질 미세환경과 접촉하게 되고 미세환경에 존재하는 섬유모세포와 cytokine, 성장인자 등 분자를 통하여 상호 작용을 일으킨다. 최근 chemokines의 신호전달이 종양세포와 기질 미세환경의 상호 작용에서 암세포의 성장, 침윤, 이동에 중요한 영향을 준다고 보고되었다. 본 연구에서 마이크로어레이를 통하여 구강편평세포암종(oral squamous cell carcinoma, OSCC) 세포주 단독 배양한 경우와 OSCC 조직에서 유래된 섬유모세포(carcinoma associated fibroblasts, CAF) 를 공동 배양한 경우를 비교하여 섬유모세포가 존재할 경우 OSCC 세포주에서 chemokine receptor를 포함한 다수의 유전자들이 발현이 증가됨을 확인하였다. 또한 CAF를 단독 배양한 경우와 암세포와 공동 배양한 경우를 비교하여 암세포가 존재할 경우 섬유모세포에서는 chemokines을 비롯한 다수의 cytokine 유전자들의 발현이 증가되었음을 알게 되었다. 이 결과를 근거로 암세포와 섬유모세포사이의 상호 작용에서 영향을 주는 CCL7의 역할을 분석하여 다음과 같은 결과를 얻었다.1. 마이크로어레이와 real-time RT-PCR를 통하여 암세포와 섬유모세포의 공동배양에서 섬유모세포 존재할 경우 암세포에서 chemokine receptor를 포함한 다수의 유전자, CCR5, CEECAM1 등의 발현이 증가되었으며, 또한 암세포와의 공동배양에 의해 섬유모세포에서는 암세포가 존재할 경우 CCL7, CXCL1, CXCL3 등의 chemokines의 발현이 증가 되었다. 이 중에서 CCL7의 발현이 가장 높았다.2. CAF에서 분비되는 CCL7에 의한 암세포 침윤성을 관찰하기 위하여 CAF 배양을 통하여 만든 conditioned media (CM)를 사용하여 OSCC 세포주 YD-10B와 HSC-2로 transwell invasion assay를 시행하였다. CM만 처리한 그룹과 CCL7 중화항체를 CM과 함께 처리한 그룹을 비교한 결과 CCL7 중화항체를 처리한 경우 암세포의 침윤성 성장이 약 50%의 감소를 보였다. 삼차원 배양에서도 CCL7 중화항체를 처리한 경우 OSCC 세포의 기질내로 침윤이 억제되었다.3. Transwell assay와 wound healing assay 실험에서 CCL7에 의한 OSCC 세포의 이동성을 관찰한 결과 CCL7를 처리한 경우 농도 의존적으로 세포 이동성이 증가하였으며 CCL7 중화항체에 의하여 억제 되었다. F-actin 형광염색에서도 CCL7 첨가에 의해 농도 의존적으로 암세포 골격의 액틴세사의 활성을 나타내어 세포돌기가 증가되어 이동성 증가를 형태학적으로 확인하였다.4. 효소결합 면역흡수 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)으로 분석한 결과 CAF와 OSCC 세포주(YD-10B, HSC-2, HSC-3, Ca9.22, YD-38)와의 공동 배양에서 CCL7의 분비는 증가하였고, 이는 OSCC 세포주의 자극으로 CAF에서 분비되었음을 확인하였다. 한편, 유방암세포주와 정상구강상피세포를 CAF로 공동배양한 경우는 CCL7의 분비 증가를 볼 수 없었다.5. 정상 치은 조직 9건, OSCC 환자의 조직 16건에 대하여 조직면역화학염색을 진행한 결과 암환자의 조직에서 7례(43%)에서 CCL7 발현을 관찰하였다.이상의 결과로 OSCC 세포의 침윤성 성장은 암세포와 섬유모세포의 상호작용으로 일어남을 알 수 있었다. 이 과정에서 다양한 chemokines의 발현이 증가 되었고 그중 CCL7은 암세포 자극에 의한 섬유모세포가 활성에 의하여 분비가 촉진하고, 섬유모세포에 의하여 분비된 CCL7은 암세포에 영향을 주어 암세포로 하여금 세포골격의 변화를 일으키며 세포이동을 촉진하여 암세포의 침윤을 유도하는 chemokines 중의 하나로 생각되었다.

[영문]Recent studies have shown that stromal fibroblasts have a more profound influence on the development and progression of carcinomas than was previously appreciated. However, the reciprocal relationship between carcinoma and stromal fibroblasts is poorly understood at both molecular and cellular levels. Microarray analysis was carried out by comparing the expression pattern between co-culture of oral squamous cell carcinoma (OSCC) cells with carcinoma associated fibroblasts (CAF) and monolayer culture of each cell type. Lots of chmokines- or their receptors-related genes were up-regulated in co-cultured OSCC as co-cultured OSCC cells with CAF. When co-clutured CAF with OSCC cells compared to monolayer CAF, many chemokines were up-regulated in co-cultured CAF. Based on Microarray results confirmed by real-time RT-PCR, this study evaluated and analyzed the role of CCL7 regarding the pro-invasive molecular cross-talk between OSCC and CAF, using a co-culture model employing collagen-coated transwells.1. Microarray and real-time RT-PCR analysis showed that CCR5 and CEECAM1 were highly expressed in OSCC cells co-cultured with CAF, compared to monolayer culture, whereas the expression of CCL7, CXCL1, and CXCL3 increased in CAF co-cultured with OSCC cells, compared to monolayer culture. CCL7 showed significantly high expression among them.2. In collagen-coated transwell assay using conditioned media(CM) obtained from co-culture with OSCC and CAF, the invasive growth of OSCC cells was reduced to 50%, when treated by CCL7-neutralizing antibody. The inhibition of invasive growth was correspondingly noticed by the treatment of CCL7 neutralizing antibody in collagen gel-based three-dimensional co-culture.3. Transwell migration assay and wound healing assay showed that CCL7 promoted dose-dependantly the migratory activity of OSCC cells, further, the migration activity was inhibited by CCL7 neutralizing antibody. Immunoflorescence staining for F-actin showed that CCL7 promoted cell spreading and membrane ruffling in OSCC cells.4. In enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), an elevated level of CCL7 secretion was released from CAF stimulated by co-cultured OSCC cells. Co-culture of CAF with breast cancer cells or normal oral epithelial cells showed no increased expression of CCL7.5. In immunohistochemical staining for CCL7, CCL7 was expressed in 7 cases out of 16 OSCC surgical specimens, whereas no positive response was observed in normal oral mucosal epithelial cells.Taken together, the invasive growth of OSCC occurs by the interaction of cancer cells and stromal fibroblasts. A variety of chemokines showed increased expression by the interaction of both cells. In particular, CCL7 that was released from CAF stimulated by OSCC cells may induce cytoskeletal alterations resulting in promoting migration and invasive growth of OSCC cells.