Hypo-osmolality increases RANKL expression by activating Ca2+ entry via TRPM3 and TRPV4 in osteoblastic cells

Abstract

[한글]

골은 조골세포와 파골세포에 의해 끊임없이 재형성과정을 거친다. 1α,25(OH)2D3는 조골세포로부터 osteoprotegerin과 receptor activator of NF-κB ligand (RANKL)이라는 주요인자를 분비하여 파골세포 분화과정을 촉진시킨다. 암괴사인자 중 하나인 RANKL은 파골 전구세포의 파골세포로의 분화, 파골세포의 활성화와 세포생존에 주요 역할을 한다. 한편, 골 개조는 fluid shear stress나 저삼투압과 같은 기계적 자극에 의해서도 조절되는데, 이는 조골세포 세포질 내 칼슘이온 농도의 증가와 세포기능에 변화를 일으킨다. 그런데 조골세포에서 삼투성 변화와 같은 기계적 자극에 의한 칼슘농도의 증가 기전과 RANKL 발현의 변화의 연관성 등은 잘 알려져 있지 않다. 이에 본 연구에서는 RT-PCR과 칼슘신호 측정, RNA 간섭 방법 등을 통해 조골세포에서 삼투성 변화시 RANKL 발현량, 세포내 칼슘신호 변화, 그리고 삼투성 변화에 의해 조절되는 칼슘통로 등을 알아보고자 하였다. 고삼투성용액은 1α,25(OH)2D3-유도성 RANKL 발현을 억제하였으며, 저삼투성 용액은 그 자체만으로 RANKL 발현을 증가시켰다. 1α,25(OH)2D3-유도성 칼슘농도의 증가는 고삼투성에 의해 억제되었으며, 저삼투성은 자체만으로 세포내 칼슘 농도를 증가시켰으며 이 반응은 가역적이었다. 세포외부의 칼슘제거, 또는 세포막 칼슘통로의 억제제인 gadolinum은 저삼투성 유도성 칼슘 농도의 증가를 각기 봉쇄하여, 저삼투성 유도성 칼슘 농도의 증가는 세포외부로부터의 칼슘 유입에 의한 것 임을 의미한다. TRPV4의 억제제인 ruthenium red나 TRPM3의 억제제인 2-APB는 저삼투성 유도성 칼슘 농도의 증가를 각기 부분적으로 봉쇄하였으며, 또한 TRPV4와 TRPM3의 RNA 간섭은 저삼투성 유도성 칼슘 농도의 증가를 각기 부분적으로 봉쇄하여 저삼투성 유도성 칼슘 농도의 증가기전에 TRPV4와 TRPM3가 관여함을 시사하고 있다. 더욱이, 저삼투성은 TRPV4와 TRPM3의 발현을 증가시켰다. 이상의 결과는 조골세포에서 저삼투압에 의한 TRPM3와 TRPV4 이온통로의 열림 활성화가 세포 외부로부터의 칼슘 유입증가를 통해 RANKL의 발현 증가를 일으킨다는 것을 의미한다.

[영문]Bone is continually remodeled by osteoblasts and osteoclasts. 1α,25(OH)2D3 activates osteoclastogenesis by releasing molecules from osteoblast, osteoprotegerin and receptor activator of NF-κB ligand (RANKL). RANKL, a tumor necrosis factor family member, plays an essential role in osteoclastic differentiation to precursors of osteoclast and in osteoclast activation and cell survival. On the other hand, bone remodeling is also regulated by mechanical stresses such as fluid shear stress, or hypo-osmotic pressure, which induce increases in intracellular Ca2+ concentration ([Ca2+]i) in osteoblasts and change the function of osteoblasts. However, the mechanism of osmolality-induced Ca2+ response and effect of osmolality on RANKL expression in osteoblastic cells are not known. In the present work, RANKL expression and Ca2+ signaling with the changes of osmotic pressure and the type of Ca2+ channel regulated by osmolality in osteoblastic cells were investigated using RT-PCR, [Ca2+]i measurement, and RNA interference.Hyper-osmolality reduced 1α,25(OH)2D3–induced RANKL expression, and hypo-osmolality itself increased RANKL expression. 1α,25(OH)2D3–induced [Ca2+]i increases were blocked by hyper-osmolality. In contrast, [Ca2+]i was increases by hypo-osmolality, and then it was a reversible response. Removal of extracellular Ca2+, or treatment with Gd3+, a non-specific blocker of plasma Ca2+ channel, inhibited hypo-osmolality-induced [Ca2+]i increases, suggesting that hypo-osmolality-induced [Ca2+]i increases are evoked from Ca2+ influx across the plasma membrane. Ruthenium red, an inhibitor of TRPV4, and 2-APB, an inhibitor of TRPM3 partially inhibited hypo-osmolality-induced [Ca2+]i increases, respectively. In addition, knockdown of TRPM3 and TRPV4 using siRNA inhibited hypo-osmolality-induced [Ca2+]i increases, respectively. Moreover, expressions of TRPM3 and TRPV4 were increased by hypo-osmolality, not by hyper-osmolality. These results indicated that hypo-osmolality increases RANKL expression by activating Ca2+ entry via TRPM3 and TRPV4 in osteoblastic cells.