PC12 세포에서 glutathione reductase 억제제로서 carmustine의 세포사 유발기전

Abstract

[한글]

Carmustine은 DNA 가닥의 교차결합을 형성시켜 세포에 영향을 주는 알킬화제제 항암제로 사용되는 약물의 일종으로서 glutathione reductase (GR)의 활성에 영향을 주는 것으로 보고되어 있다. GR은 세포내에서 산화형의 glutathione (GSSG)을 환원형의 glutathione (GSH)으로 전환시키는 효소로서 활성산소종과 외부 독성물질 등의 작용을 막는데 영향을 미치고, 세포내 산화-환원 조절에 매우 중요한 역할을 한다. 따라서 carmustine에 의해 GR 활성이 감소하면 세포내 GSH양을 줄어들게 하여 세포가 독성 물질에 더 민감해진다.본 연구는 분화된 PC12 세포에서 GR에 대한 carmustine의 영향과 그에 따른 세포내 기전을 알아보고자 하였다.먼저 carmustine이 농도 및 시간에 비례하여 PC12 세포사를 유발하는 것을 확인하였다. 또한 carmustine을 처리한 경우에 GR 활성을 억제시켜 그에 따른 결과로 세포내 GSH 수준이 대조군에 비하여 감소되는 결과를 얻었다. 세포내 GSH 수준의 감소로 인하여 세포내 활성산소종을 축적시키는지 알아보기 위하여 CM-H2-DCFDA를 세포내 축적시키고 flow cytometry로 분석하였다. Carmustine을 처리한 30분부터 활성산소종이 증가되어 1시간 후에 최대에 도달한 후 유지되었으며, 활성산소종을 제거하는 N-acetyl-L-cysteine (NAC)과 trolox와 세포내 단백을 환원시키는 DTT를 전처리 한 경우 carmustine에 의한 세포사가 억제되었다. 이는 활성산소종이 carmustine으로 인한 세포사에 주요 역할을 하는 것으로 제안된다. Carmustine의 세포사 기전으로 caspase-3와 mitogen-activated protein kinases (MAPK)가 관련되었는지를 Western blotting을 통해 알아본 결과 500 μM carmustine 처리 1시간 이후부터 caspase-3의 활성화가 관찰되어 3시간째에 뚜렷하게 되고 MAPK중에 c-Jun N-treminal kinase (JNK)가 강하게 활성화되는 것이 확인되었으며 caspase-3와 JNK의 활성화는 활성산소종을 제거하는 NAC에 의해 억제됨을 보였다. MAPK의 인산화가 carmustine에 의한 PC12 세포의 세포사 원인인지 확인하기 위하여 ERK, JNK, P38을 억제하는 PD98059, SP600125, SB203580을 사용하여 세포생존율을 측정한 결과 SP600125를 처리했을 때와 PD98059와 SP600125를 함께 처리했을 때 세포생존율이 증가됨을 보였다.그러나 p38 억제제인 SB203580는 세포생존율을 거의 증가시키지 못했다.이상의 결과로 볼 때 항암제인 carmustine은 PC12 세포에서 GR을 억제함으로써 세포내 활성산소종을 축적시키고 이로 인해 ERK, JNK 및 p38을 활성화시키는데, 이들 중에서 ERK와 JNK의 활성화가 caspase-3의 활성화를 매개하여 세포사를 유발하는 것으로 생각된다.

[영문]Carmustine is one of the alkylating anti-cancer drugs that exert their cytotoxic effects by crosslinking the strands of DNA. However, it has also been documented that glutathione reductase (GR) is very susceptible to inactivation by carmustine. GR is a critical enzyme in the homeostasis of intracellular concentrations of glutathione (GSH). GSH is the primary line of defense for many toxic insults, including reactive oxygen species and xenobiotics, and is also involved in other redox pathways. Therefore, it is possible that decreased GR activity could facilitate the cytotoxicity of carmustine not only in cancer cells but also in non neoplastic tissues. In fact, there are well-documented harmful consequences of a systematic depression of GR activity, particularly in pulmonary tissue as well as the intestine, liver, and kidney, where an environment of depleted GSH renders these tissues hypersensitive to toxic insults.Therefore, in the present study, we aimed to investigate the effect of carmustine on GR inhibition and the downstream signaling pathways leading to cell death.Carmustine induced PC12 cell death in a dose- and time-dependent manner. Carmustine also induced an inhibition of GR activity and a decrease in intracellular GSH level. The depletion of GSH led to the production of reactive oxygen species (ROS) and the anti-oxidants and reducing agent prevented PC12 cell death, suggesting that ROS played a major role in carmustine-induced cell death. Carmustine induced the activation of capase-3 and two members of MAPKs, ERK and c-Jun N-treminal kinase (JNK). The cell death and the activation of caspase-3 were prevented by ERK and JNK blockers, indicating that ERK and JNK were involved in the carmustine-induced cell death pathway.In conclusion, as a GR inhibitor, carmustine induces cell death probably via activation of ERK, JNK, and caspase-3 through the increased accumulation of ROS, resulting from the depletion of GSH in PC12 cells.