Protein kinase C 매개 인산화에 의한 HMGB1 분비 조절 기전

Abstract

[한글]

HMGB1은 진핵세포에 존재하여 핵 안에서 DNA의 전사를 조절하는 핵단백으로 알려졌으나 lipopolysaccharide (LPS), tumor necrosis factor (TNF)-α, interferon (IFN)-γ의 자극에 의해 세포 밖으로 분비된다. 분비된 HMGB1은 전염증성 cytokine의 성질을 가지며 이는 동맥경화, 패혈증, 관절염, 출혈성 쇼크 등의 systemic inflammation에 주요한 매개 물질이다. HMGB1은 인산화, 아세틸화 등의 post-translational modification 을 거치게 되면 DNA와 결합력이 약해지면서secretory lysosome을 거쳐 세포 밖으로 분비된다. 본 실험실에서는 선행연구를 통해 HMGB1의 인산화가 분비를 일으키는 주요한 기전임을 보고하였다. 그러나 HMGB1 분비와 관련되는 신호전달과정은 아직 잘 알려지지 않았다. HMGB1의 분비기전을 규명하는 것은 패혈증을 포함한 다양한 염증 질환의 치료제를 개발하기 위해 필수적이다.본 실험은 LPS에 의해 활성화되는 mitogen-activated protein kinase (MAPK), nuclear factor (NF)-κB, phosphatidylinositide 3-kinase (PI3K) 억제제를 사용하여 실험한 결과, HMGB1의 분비는 PI3K 와 연관성이 있음을 밝혔다. 또한PI3K의 downstream에 있는 protein kinase B (Akt), mammalian target of rapamycin (mTOR), conventional protein kinase C (cPKC) 억제제를 사용하여 HMGB1의 분비에 영향을 관찰한 결과 cPKC inhibitor가 HMGB1 분비를 감소시켰다. γ-[32P]를 사용한 in vitro kinase assay 상에서 cPKC가 HMGB1을 인산화 시킨 것을 확인 할 수 있었다. cPKC는 HMGB1의 nuclear localization sequence (NLS)에 있는 serine을 alanine으로 치환시킨 mutant HMGB1을 인산화 시키지 못했다. 이 결과들을 토대로 cPKC는 HMGB1 NLS의 serine을 인산화 시키는 kinase로 HMGB1의 분비를 조절하는 kinase임을 알 수 있었다. 세포 내에서 Ca2+이 증가되면 HMGB1의 분비가 일어나고 Ca2+이 억제되었을 경우 LPS 자극 후에도 HMGB1의 분비가 감소하는 것으로 보아 HMGB1의 분비는 Ca2+에 의해 조절 받으며, cPKC는 Ca2+에 의해 활성화 되므로 이를 통해 HMGB1의 분비는 Ca2+ 의존적인 cPKC의 활성화와 관련성이 있을 것으로 생각된다.이와 함께 항염증적 특성이 보고된 부자 유래의higenamine 유도체를 사용하여 HMGB1 분비에 미치는 영향을 규명하고자 하였다. Higenamine 유도체를 사람 단구와 RAW264.7세포에 처리하였을 때, LPS 자극에 의해 야기되는 핵에서 세포질로의 HMGB1이동이 억제되었으며, 결과적으로 HMGB1의 분비가 감소하였다. 또한 γ-[32P]를 사용한 in vitro kinase assay상에서도 higenamine 유도체가 cPKC 억제제와 유사하게 HMGB1의 인산화를 감소시켰다. 이를 통해higenamine 유도체가 HMGB1의 인산화를 일으키는 cPKC의 작용을 직접적으로 억제하여 HMGB1의 분비를 감소시키는 것으로 생각된다.본 연구를 통해 HMGB1의 분비를 야기시키는 인산화 과정을 규명하여 HMGB1 매개 염증반응의 조절가능성을 제시하였다. 그리고 higenamine 유도체는 HMGB1의 인산화를 억제하여 그 분비를 감소시키는 것을 확인하여 HMGB1 매개 패혈증 치료제로써의 가능성을 제시하였다.

[영문]High mobility group box-1 protein (HMGB1), which is secreted from activated monocytes/macrophages, has been studied as a key late mediator of systemic inflammatory diseases including sepsis, ischemia/reperfusion. The regulation of secretion is important to control the systemic inflammation diseases. Phosphorylation of HMGB1 is one of the major secretion pathways in our previous report. To investigate the phosphorylation-related pathway of HMGB1, LPS-induced HMGB1 secretion was observed with various inhibitors in RAW264.7 cells and human monocytes. When RAW264.6 cells were pre-treated with SP600125 (JNK inhibitor), PD098059 (ERK inhibitor) and SB203580 (p38 inhibitor), LPS-induced HMGB1 secretion was not changed. SN-50 and Bay-11, the NF-κB inhibitors, also failed to inhibit HMGB1 secretion. However, wortmannin and LY294002 inhibited HMGB1 secretion, suggesting that phosphoinositide 3-kinase (PI3K) is involved in secretion of HMGB1. Akt inhibitor IV and rapamycin failed to inhibit HMGB1 secretion, suggesting no relevance of Akt-mTOR axis pathway. In contrast, protein kinase C (PKC) inhibitor Gö6983 and Ro-31-7549 could inhibit HMGB1 secretion. And it is confirmed by that HMGB1 was directly phosphorylated by conventional PKCs (cPKCs) but not by casein kinase II or cdc2 in in vitro kinase assay. A23187, a calcium ion specific ionophore, could induce HMGB1 secretion without LPS stimulation and BAPTA-AM, an intracellular calcium ion chelator, could block LPS- induced HMGB1 secretion, supporting that Ca2+-dependent cPKC activation is involved in the secretion of HMGB1. Also, we investigated an effect of higenamine derivative (CKD-712) on HMGB1 secretion, which has been studied as a candidate drug for sepsis. CKD-712 could inhibit LPS-induced HMGB1 secretion on RAW264.7 and human monocyte and inhibit HMGB1 translocation from nucleus to cytoplasm. In vitro kinase assay, HMGB1 phosphorylation by cPKCs was reduced by CKD-712 in a dose-dependent manner. Taken together, we propose that cPKCs is an effector kinase for HMGB1 phosphorylation, which is one of the secretion pathways, and PI3K may act in concert to control of HMGB1 secretion via independent manner of MAPK and NF-κB pathways. Also, we suggest that CKD-712 could be one of the novel drugs to inhibit HMGB1 secretion.