유방암 환자 혈액의 fatty acid synthase 발현의 양적인 차이를 보기 위한 enzyme-linked immunoassay 정량법

Abstract

[한글]

유방암은 미국이나 유럽 등 선진국가에서의 여성 암 중에서 가장 흔한 암으로 미국 여성의 제 1의 사망원인이 되고 있다. 최근에는 비만과 관련된 지방산 합성 과정과 유방암과의 연관성이 연구되었다. 더욱이 유방암의 예후 분자로 알려진 oncogenic antigen-519이 1994년 Kuhajda등에 의하여 fatty acid synthase (FAS 또는FASN) 임이 밝혀지면서, 유방암의 표식자로서 FAS에 대한 연구가 시작되었다. FASN는 세포질내 존재하는 효소로서 정상적인 상태에서는 세포외액에 존재하지 않는다. 그러나, 유방암 세포주는 특징적으로 배양액으로 FAS를 분비한다는 사실이 보고되었으며, 최근에는 유방암을 포함한 여러 암환자의 혈액에서 비정상적으로 FAS가 높게 검출된다고 보고되었다. 즉, 유방암 환자의 83%, 전립선암 환자의 53%, 대장암 환자의 90%, 난소암 환자의 40 % 에서 혈장내 높은 농도의 FAS가 검출되었다.본 연구에서는 사람의 혈액내에 있는 단백질의 양을 측정하기 위해서, 사람의 세포주(SkBr-3)와 쥐의 간에서 분리된 FAS 단백질을 정제하고, 이 단백질을 표준농도로 설정하여, enzyme linked immunoassay 방법 중에 하나인 two-site sandwich ELISA (2s-ELISA)를 이용한 FAS의 정량법을 설정 하였다. 항원 단백질로는 쥐의 간에서 추출한 FAS보다는 사람 세포주 (SkBr-3)에서 분리한 FAS가 더 control로서 유용하리라고 판단되었다. 따라서, 사람의 혈액 안에 있는 FAS 단백질만을 검출하기 위하여 재조합되지 않은 동물 세포에서 직접 분리된 FAS 단백질을 이용하여 만든 polyclonal anti-FAS 항체와 biotin이 붙은 monoclonal 항체를 이용한 2s-ELISA를 시도하였을 때, 인간의 혈액 안에 있는 FAS 단백질을 검출되는 것으로 확인되었다. 또한, 유방암 세포주들과 다른 세포주들의 배양액에서도 FAS 단백질의 양을 측정해 본 결과 SkBr-3, BT-474, MCF-7 세포주들에서 특이적으로 높게 검출되는 것을 확인되었다. 마지막으로, 정상인과 유방암 환자군의 혈액에서 FAS양을 측정해 보았을 때, 유방암 환자군에서 좀 더 많은 양의 FAS 단백질이 검출 되었고, 나이에 따라서도 42세 이전보다는 이후의 환자군에서 FAS의 양이 좀 더 검출 되는 것이 확인되었다. 앞으로, 위와 같은 실험방법을 더욱 개발하고 개선 함으로서, 유방암 환자의 임상정보에 따라 어떤 유의한 변화가 있는지 상관관계를 분석해 볼 수 있기를 기대해 본다.

[영문]

Breast cancer is the most frequent cancer among female cancers in advanced countries such as the U.S. or Europe, which has been the primary cause of death in U.S. women. Recently, relation between synthesis of fatty acid and breast cancer was studied as associated with fatness. Furthermore, as oncogenic antigen-519 known as a prognostic factor of breast cancer was founded to be fatty acid synthase (FAS or FASN) by Kuhajda et al. in 1994, studies on FAS, which is an indicator of breast cancer, were begun. The FAS, an enzyme existing in the cytoplasm, does not exist in the extra cellular fluid (ECF) under normal condition. However, it was reported that the breast cancer cell lines would specifically secret FAS as culture medium, and recently that FAS was abnormally detected at high levels in the blood of cancer cases including breast cancer; a high level of FAS in plasma was detected from 83% of breast cancer patients, 53% of prostate cancer patients, 90% of colon cancer patients, and 40% of ovarian cancer patients.In this study, to measure an amount of protein in human blood, FAS protein separated from the human cell line (SkBr-3) and the rat liver was purified, the protein was set at standard concentration, and FAS assay was set up with two-site sandwich ELISA (2s-ELISA), one of enzyme linked immunoassays. It was deemed that as antigen protein, rather FAS separated from the human cell line (SkBr-3) than that extracted from the mouse liver would be more useful as control. Therefore, when 2s-ELISA was attempted using both the polyclonal anti-FAS antibody made with FAS protein directly separated from non-recombined animal cell to detect only FAS protein in human blood and the monoclonal antibody attached with biotin, FAS protein in human blood was detected. Also, after an amount of FAS protein was measured in the culture medium of different cell lines from breast cancer cell lines, it was specifically detected at a high level in the SkBr-3, BT-474, and MCF-7 cell lines. Finally, when an amount of FAS was measured in the blood of healthy persons and patients with breast cancer, a more amount of FAS protein was detected in breast cancer patients, and regarding age, a more amount of FAS was detected in patients aged above 42 than those aged under 42.The author expects that correlation of significant changes with clinical information of breast cancer patients will be analyzed by further developing and improving the above mentioned experimental method.