Comparative study of thymidylate synthase assessments and E2F-1 expression to predict the patient's survival in colorectal adenocarcinoma

Abstract

[한글]

연구배경: 대장암은 서구에서 사망을 초래하는 암 중 두번째로 흔한 암이며, 생활습관의 변화로 인하여 최근 국내에서도 급격히 빈도가 증가하는 추세이다. 5-Fluorouracil (FU)은 진행성 또는 재발성 대장암환자의 치료에 사용하는 가장 대표적인 항암제로써 DNA의 합성과 복구에 중요한 역할을 하는 thymidyalte synthase(TS)를 표적으로 하는 약제이다. 그러므로 대장암에서 5-FU의 항암효과 및 종양의 예후를 알아보기 위하여 종양내 TS의 발현을 검사하는 것이 임상적으로 유용한지를 알아보기 위한 다수의 연구가 보고되어왔다. 현재까지 소개된 TS발현에 대한 검사방법으로써 비교적 유용한 것으로 기술된 것은 면역조직화학염색법을 이용한 TS의 단백 발현, TS mRNA 정량검사, TS유전자의 다형성 검사 등이다. 그러나 아직까지 TS 검사의 임상적 유용성에 대해 논란이 많으며 검사판독의 표준화도 이루어 지지 않았다. E2F1은 전사인자 중 하나로써 세포 주기를 조절하는데 중요한 역할을 하며, TS 발현과 연관이 있다고 보고된 바 있지만 그 작용 기전이나 임상적 의의에 대해서는 아직 잘 밝혀져 있지 않다. 본 연구에서는 대장암의 치료 후 예후를 측정하는데 유용한 인자를 찾기 위하여 면역조직화학염색을 이용한 TS 단백발현, real-time RT-PCR을 이용한 TS mRNA 발현, TS 유전자 다형성에 대한 검사와 함께 E2-F1단백 발현을 검사하여 비교, 분석함으로써 대장암환자에 TS와 E2-F1검사의 유용성을 검사 하였다.

연구 재료 및 방법: 연세대학교 원주의과대학에서 대장암으로 외과적 절제술을 시행하고 추적관찰이 된 168명의 환자를 대상으로 하였다. 추적기간은 3개월~121개월이었으며 그 중 104명 환자는 수술 후 5-FU를 기본으로 한 항암치료를 받았다. 병기는 1기 19예, 2기 58예, 3기 51예, 4기 39예였으며 1예는 병기를 알 수 없었다. 종양의 위치는 상행결장 46예, 횡행결장 10예, 하행결장 10예, S상 결장 34예, 직장 68예였다. 파라핀에 포매된 조직으로 제작한 tissue microarray를 이용하여 TS와 E2F1에 대한 면역조직화학염색을 시행하였으며 발현 정도의 판정은 TS의 경우 종양내 양성세포의 빈도와 강도를 고려하여 0부터 4까지 5등급으로 나누었고, E2F1의 경우 양성세포의 빈도에 따라 0부터 4까지 5등급으로 구분하였다. 환자의 종양조직과 정상조직을 이용하여 RotorGene real-time quantitative PCR 방법으로 mRNA를 측정하였으며, 종양내 발현과 종양:정상의 비율을 구하여 비교하였다. 환자의 정상과 종양 조직의 DNA를 측출하여 5’ enhancer region tandem repeat(5’ TSER)와 3’ untranslated region(3’ TSUTR)의 유전자 다형성을 검사하였다. 또한 일반적인 TS 유전자 다형성을 알아보기 위하여 종양이 없는 일반 환자의 대장 조직을 이용하여 유전자 다형성을 비교 검토하였다.

연구 결과: TS에 대한 면역조직화학염색 결과는 환자의 병기 및 예후와 유의한 연관성이 없었다. 종양에서 측정한 TS의 mRNA의 평균값은 11.39±21.96에 반해 정상조직에서의 평균값은 3.71±7.55이었고 정상에 대한 종양 mRNA 값의 비율은 4.39±6.48이었다. 정상조직에서 mRNA의 값은 0.11부터 62.0으로 다양하였고 대응하는 종양 조직 내에서의 mRNA의 값과 유의한 연관성을 보였다. 하지만 종양내 TS mRNA의 발현이나 종양:정상조직의 mRNA 비율은 환자의 예후와 연관성이 없었다. 환자군에서 종양내 유전자형은 대응하는 환자의 정상조직의 유전자형과 일반적으로 일치하였다. 5’-TSER에서 3R/3R 유전자형이 74.0%, 2R/3R형은 21.8%, 2R/2R형은 4.2% 였으며 암이 없는 일반 환자에서 3R/3R 66.7%, 2R/3R은 33.3%로 비교적 유사한 분포를 보였다. 3’ TSUTR의 경우 6bp 결손을 보인 경우는 76.9%, 이형접합을 보인 예는 23.1% 였고 암이 없는 환자에서도 각각 63.6%와 36.4%로 비슷한 분포를 보였다. 유전자 다형성 검사의 생존분석에서 5’ TSER의 3R/3R 유전자형이 병기 3에서만 예후와 연관성을 보였다(r=0.88856, p=0.0001). 그러나 다변량분석에서는 유의한 연관성을 보이지 않았으므로 예후인자로 사용할 수 없다. 면역조직화학염색에서 E2-F1이 3등급이상의 높은 발현을 보인 환자는 발현이 음성, 1등급, 또는 2등급인 환자에 비해 나쁜 예후를 나타냈다(p=0.0115). 다변량분석에서도 E2-F1의 발현과 예후 사이에는 통계학적 유의성이 있었으므로 독립적인 예후인자로 사료된다(p=0.036). 각 검사의 연관성을 분석한 결과 TS 발현 및 TS 유전자형과 E2F1의 발현간에 연관성은 관찰되지 않았으나 5’-TSER의 3R/3R/과 3’-TSUTR의 6bp 결손은 유의한 연관성이 있었다(p=0.045).

결론: 이상의 결과로 대장암 환자에서 예후를 알아보기 위해서는 TS에 대한 검사보다 E2F1 발현에 대한 검사가 더 유용하다고 사료된다. 그러나 E2F1이 종양억제 기능 등의 다양한 역할을 가지고 있으므로 대장암에서 E2F1의 역할, 항암제 반응에 대한 기전에 대한 연구가 필요하며, 나아가서 E2F1을 표적으로 한 새로운 항암제 개발에 대한 연구가 필요하다고 사료된다

[영문]

To determine the best routinely available prognostic assessment for thymidylate synthase (TS) and E2F-1 in colorectal adenocarcinoma, TS was comparatively analyzed at the protein, mRNA and DNA levels and E2F-1 was analyzed at protein level. We studied 168 surgically resected colorectal adenocarcinoma patients with follow-up ranging from 3 to 121 months (mean 73±40 months), of which 104 also received postoperative 5-FU chemotherapy. TS immunohistochemistry was performed on tissue microarrays. RotorGene real-time quantitative PCR and PCR genotyping of the 5’ enhancer region tandem repeat (5’-TSER) and the 3’ untranslated region (3’-TSUTR) were performed on matched tumor and normal tissues. 12 surgically resected colon without adenocarcinoma were included for TS genepolymorphism in normal population.TS immunohistochemistry did not correlate with survival, related in part to tumor heterogeneity and observer variability. Mean TS mRNA expression was 11.39±21.96 in tumor and 3.71±7.55 in matched normal tissue, with an average tumor:normal ratio of 4.39±6.48. Surprisingly, mRNA values in normal tissue varied from 0.11 to 62.0 and significantly correlated with mRNA values of matched tumor tissues. Regardless, neither TS mRNA levels nor tumor:normal ratios correlated with survival. TS tumor genotype was generally concordant with matched normal tissues. Distribution of gene polymorphism of TS in patients with tumor was similar to normal population. 3R/3R genotype in 5’-TSER was related to 6bp deletion genotype in 3’-TSUTR (p=0.045). Further, 3R/3R genotypes in 5’- TSER revealed significantly improved survival only in stage III tumors(r=0.8856, p=0.0001). However, it wasn’t an independent prognostic marker after multivariate analysis. On the other hand, tumors with high E2F1 immunoexpression revealed a significant correlation with poorer survival than tumor with low expression (p=0.0115). E2F-1 was an independent prognostic factor in multivariate analysis (p=0.036).

In conclusion, the evaluation of E2F1 expression was more useful than TS assessment to predict the outcome in colorectal adenocarcinoma treated with 5-FU chemotherapy after surgical resection