사람 간암세포주에서 포도당 대사 억제제 3-bromopyruvate에 의한 세포사멸 기전

Abstract

[한글]

암세포는 정상 세포보다 많은 포도당을 소비하는 비정상적인 에너지 대사를 보인다. 암세포에서의 증가된 포도당분해는 주로 미토콘드리아 기능 이상과 저산소성 미세환경에 의하며, 이를 Warburg effect라 한다. 이 과정에서 hexokinase II (HK II)는 암세포에서 증가된 포도당 분해를 유지하는 데 필수적인 효소로서, 실제로 많은 종양세포에서 과발현되어 있으며, 종양의 악성상태를 유지하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 암세포에서 HK II를 억제하여 증가된 포도당분해를 억제시킴으로써 항암치료를 하고자 하는 연구가 이루어졌으며, 3-bromopyruvate (3-BrPA)가 대표적인 HK II 억제제로 알려져 있다. 이를 이용하여 세포주 및 실험동물 실험에서 세포사멸이 유발되어 항암효과를 발휘하는 것이 알려졌으나, 확실한 세포사멸의 기전은 정립되어 있지 않다. 또한, 3-BrPA는 결핵균에서 isocitrate lyase의 억제 효과도 있음이 알려져 있어, 3-BrPA가 HK II의 특이 억제제인지의 여부도 불분명한 상태이다. 따라서 본 연구에서는 사람 간암세포주를 대상으로 3-BrPA에 의한 암세포의 세포사멸이 HK II의 발현과 관계가 있는지를 밝히고, 3-BrPA가 세포사멸을 유도하는 기전을 규명하고자 하였다.3-BrPA가 사람 간암세포주 Hep3B (HK II 과발현세포)와 SNU-449 (HK II 발현이 적은 세포)를 대상으로 세포사멸에 미치는 영향을 조사하기 위해, 3-BrPA를 시간과 농도를 다르게 처리하여 MTT 분석과 annexin V-propidium iodide (PI) 염색을 수행하였다. 이때의 세포사멸이 caspase 의존적인가를 알아보기 위해 세포를 pan-caspase inhibitor인 z-VAD-fmk로 전처리한 후 3-BrPA를 첨가하여 MTT 분석으로 세포사멸을 조사하고 caspase-3의 절단을 Western blot으로 관찰하였다. 3-BrPA 투여 후 JC-1 염색으로 미토콘드리아 막전위 변화를 조사하였고, 미토콘드리아에서 세포질로의 cytochrome c 유출을 Western blot으로 확인하였다. 3-BrPA 처리에 의한 세포내 reactive oxygen species (ROS) 생성은 CM-H2DCFDA를 사용하여 측정하였고, 항산화제인 N-acetyl-L-cysteine (NAC)을 전처리 한 후, 3-BrPA를 가한 후 MTT 분석과 annexin V-PI 염색을 시행하여 세포사멸을 측정하고, JC-1 염색으로 미토콘드리아 막전위 변화를 조사하였다.3-BrPA는 HK II 과발현 Hep3B 세포와 HK II 발현이 적은 SNU-449 세포 모두에서 농도와 시간에 의존적으로 세포사멸을 유도하였다. 3-BrPA에 대한 감수성은 Hep3B 세포에서 높았으며, SNU-449 세포에서는 상대적으로 낮았다. 3-BrPA 처리 후 활성화된 caspase-3와 PARP의 절단 산물인 p89는 검출되지 않았으며, 두 세포주 모두에서 z-VAD-fmk에 의해 3-BrPA에 의한 세포사멸이 억제되지 않아 caspase 비의존적인 세포사멸임을 확인하였다. Hep3B 세포에서는 미토콘드리아에서 세포질로 cytochrome c가 유출되었으나, SNU-449에서는 유출되지 않았다. 3-BrPA에 의한 ROS의 생성은 두 세포주 모두에서 관찰되었고, 미토콘드리아 막전위는 시간 의존적으로 감소하였다. NAC의 전처치는 두 세포주 모두에서 3-BrPA에 의한 세포사멸을 억제하였고, 3-BrPA에 의해 유발된 ROS의 생성과 미토콘드리아 막전위 감소를 억제하였다.3-BrPA에 의한 Hep3B와 SNU-449 세포의 세포사멸은 세포내 ROS 생성을 통한 산화적 스트레스와 미토콘드리아의 기능 저하를 통해 유발되며, 이러한 현상은 HK II가 발현되지 않는 SNU-449 세포에서도 관찰되었다.결론적으로 3-BrPA가 사람 간암세포주에서 암세포를 사멸시키는 기전에는 이전 연구에서 보고된 HK II 억제에 의한 에너지 생산의 저해와 caspase 의존적인 세포고사를 통한 기전 외에 세포내 ROS 형성을 통한 미토콘드리아의 기능 이상을 통해 caspase 비의존적인 기전의 세포사멸이 있음을 추측할 수 있다.

[영문]

Many cancer cells exhibit aberrant energy metabolism consuming more glucose than normal cells (the Warburg effect). Increased glycolysis in cancer cells is mainly attributed to mitochondirial respiration injury and hypoxic microenvironment. Hexokinase isoenzyme type II (HK II) is the key enzyme that maintains the increased glycolysis in cancer cells, and is overexpressed in many cancer cells. HK II plays a pivotal role in survival of malignant cells and has been an ideal target for anticancer chemotherapy in many studies. It has been reported that 3-bromopyruvate (3-BrPA) induced cell death in cancer cells by inhibition of HK II and glycolysis in vivo and in vitro studies. However, 3-BrPA also has an inhibitory effect on isocitrate lyase in Mycobacterium tuberculosis infection. Moreover, it is not clear whether 3-BrPA is a specific inhibitor of HK II. Therefore, the mechanism of cell death induced by 3-BrPA has not been well clarified.The purpose of this study was to elucidate the possible molecular mechanisms of 3-BrPA-induced cell death using the two human hepatoma cell lines which show over and low expression of HK II respectivelyMTT assay and annexin V-propidium iodide (PI) staining were performed in human hepatoma cells, Hep3B (HK II, positive) and SNU-449 (HK II, negative) after treatment of 3-BrPA with various concentration and time. Pan-caspase inhibitor, z-VAD-fmk was pretreated and MTT assay was performed after the treatment of 100 μM 3-BrPA, and followed by Western blotting to analyze the cleavage of caspse-3. After treatment of 3-BrPA, mitochondrial membrane potential was assessed with JC-1 staining. Western blotting was performed with anti-cytochrome c antibody after fractionation of the cytosolic and mitochondrial proteins. Production of cellular reactive oxygen species (ROS) was assessed with cell permeable fluorescent dye, CM-H2DCFDA and fluorescence densitometric analysis. 3-BrPA induced cell death was assessed with MTT assay and annexin V-PI staining after pretreatment of anti-oxidant, N-acetyl-L-cysteine (NAC), and mitochondrial membrane potential was assessed with JC-1 staining.3-BrPA induced cell death was seen in both Hep3B and SNU-449 cells with dose and time dependency. Hep3B cells were more susceptible to 3-BrPA than SNU-449 cells. Caspase activation and PARP cleavage were not detected and Z-VAD-fmk did not block 3-BrPA-mediated cell death. Therefore, 3-BrPA induced cell death mechanisms could be caspase-independent. The release of cytochrome c was noted only in Hep3B cells. 3-BrPA increased intracellular ROS level leading to mitochondrial membrane potential loss in both cell lines. NAC, an antioxidant, inhibited 3-BrPA-induced ROS production, loss of mitochondrial membrane potential and cell death in both cell lines.In conclusion, cell death induced by 3-BrPA in Hep3B and SNU-449 cells would be mediated, in part, by the oxidative stress of ROS production and mitochondrial dysfunction, in addition to the known mechanism of inhibition of HK II, energy depletion and caspase-dependent cell death.