Nestin expression during differentiation of fetal endothelial progenitor cells, and hypoxic culture of human umbilical vein endothelial cells

Abstract

[한글]

목적: 제 4형 중간형 미세단백질로 알려진 nestin은 내피세포의 혈관증식 및 혈관신생 능력을 평가하는 표지자로 사용할 수 있음이 알려져 있다. 이런 nestin에 대해서 연구를 통해서, 최근 우리는 정상산모에서보다 전자간증 산모의 태반에서 nestin이 더 많이 발현함을 발표하였다. 제대혈액내의 내피전구세포는 혈관증식, 기관형성, 손상된 혈관의 치료에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 본 연구의 목적은 내피전구세포의 분화과정과 제대정맥 내피세포의 저산소 배양과정에서 nestin 발현의 변화를 확인하고자 하는 것이다.연구대상 및 방법: 임신 제 37주부터 40주 사이에 분만된 15명의 산모를 대상으로 50 ml의 제대혈액 및 제대를 태아 분만 직후 획득하였다. 내피전구세포는 제대혈액 내에서 단핵세포를 얻은 후, 이 중 섬유결합소 (fibronectin)에 부착된 세포만을 획득하여 7일간 배양한다.7일간의 배양 후, 이 세포들은 1,1''-dioctadecyl-3,3,3'',3''- tetramethylindocarbocyanine-labeled acetylated low-density lipoprotein (acLDL-DiI)과 FITC-labeled Ulex europaeus agglutinin-1 (UEA-1)을 이용한 형광발현을 통하여 내피전구세포임을 확인하고, 다시 15일간의 분화 과정을 거쳐서 증식내피세포 (outgrowth endothelial cell, OEC)로 분화가 유도된다. 제대정맥 내피세포 (human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)는 M199 배양액을 통해 배양을 하며, 정상 산소 배양을 위해서는 5% CO2와 95%의 공기가 사용 되었고, 저산소 배양을 위해서는 5% CO2와 94%의 N2 그리고 1%의 O2가 사용 되었다. HUVEC의 배양은 24시간 유지 되었다. 내피전구세포, 증식내피세포, 제대정맥 내피세포에서의 nestin 유전자 발현을 확인하기 위해 semi-quantitative RT-PCR (sqRT-PCR)이 사용되었다.결과: Nestin 유전자는 내피전구세포에서 발현되지 않았으나, 증식내피세포로 분화되면서 유전자 발현이 나타났으며, 제대정맥 내피세포에서도 증식내피세포와 비슷한 양상으로 nestin 유전자의 발현이 확인되었다. 제대정맥 내피세포를 24시간 저산소 배양한 결과, nestin 유전자의 발현 양상은 변하지 않았다.결론: 본 연구에서 nestin은 내피전구세포의 새로운 분화 표지자로 사용될 수 있는 가능성을 보여주었다. 그리고, 제대정맥 내피세포에 있어서 저산소 자극이 직접적으로 nestin 유전자의 발현을 조절하지는 않는 것을 확인할 수 있었다.

[영문]

Objective: Recent reports have documented that Nestin, a type VI intermediate filament protein could be used as a marker of angiogenesis and neovascularization capacity of endothelial cell. Our previous study showed that the Nestin expression was different in placentas from normal pregnant women and women with severe preeclampsia. Umbilical cord blood EPCs play an important role in angiogenesis, organogenesis, and vascular repair by the processes. The aim of this study is to assess whether Nestin is expressed during differentiation of EPCs obtained from human umbilical cord blood (HUCB), and its expression is changed in hypoxia-conditioned culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVECs).Materials and Methods: Among deliveries at our institute, 15 normal pregnant women who delivered by cesarean section at 37 ~ 40 weeks of gestation were selected. About 50 ml of umbilical cord blood and cord at the time of delivery were obtained. Human umbilical cord blood mononuclear cells (MNCs) from HUCB were isolated and cultivated on 6-well plates coated with human fibronectin in endothelial basal medium-2 (EBM-2). Cultures were maintained for day 7. On the seventh day, EPCs were characterized by detecting the uptake of 1,1''-dioctadecyl-3,3,3'',3''-tetramethylindocarbocyanine-labeled acetylated low-density lipoprotein (acLDL-DiI), and FITC-labeled Ulex europaeus agglutinin-1 (UEA-1). After the characterization of EPCs, cell culture was continued through day 15 for differentiation to outgrowth endothelial cell (OEC). HUVECs were isolated from human umbilical cord veins by collagenase treatment, and were grown in M199 medium. For normoxia experiments, the HUVECs were cultured at 37 ℃ in humidified 5% CO2/95% air, and for hypoxia, they were cultured at 37 ℃ with 5% CO2, 94% N2, and 1% O2 in a multi-gas incubator. Culture in hypoxic conditions was performed for 24 hours. Nestin gene expression in EPCs, OECs, and HUVECs was detected by semi-quantitative RT-PCR (sqRT-PCR). To identify hypoxic effects in culture of HUVECs, VEGF expression was co-detected.Results: sqRT-PCR revealed that Nestin gene was downregulated in EPC, but upregulated in OECs and HUVECs. During 24 hours of HUVEC culture, time course gene expression of VEGF was significantly increased, but Nestin was not changed.Conclusions: These results suggested that Nestin could be used as a new differentiation marker of fetal endothelial cell. But our studies showed that hypoxic stimuli did not directly affect nestin gene expression.