The effect of Helicobacter pylori infection on sonic hedgehog signal pathways in gastric epithelial cells

Abstract

[한글]

최근 암의 발생과정은 분화가 끝난 세포에서 생기는 것이 아니라 각 장기에 위치한 성체 줄기세포에서 생긴다는 보고들이 나오면서 정상적인 분화에 관여되는 신호전달체계에 관심을 가지게 되었으며, 여러 연구들을 통하여 정상적인 분화에 관여되는 신호전달과정이 발암과정에 관여됨이 보고 되었다. 이중 대표적인 것이 Hedgehog (Hh) 신호전달과정이다. 만성적인 자극이 발생, 분화에 관여하는 신호체계를 비정상적으로 자극한다는 개념에서 발암과정에 관여된다는 관점이나, 실제로 이의 기전자체를 조사한 연구들은 거의 없다. 따라서 이번 연구과제에서는 위의 대표적 만성자극중의 하나인 Helicobacter pylori (H. pylori) 감염이 위암발생에 있어 Hh 신호전달과정에 미치는 영향을 밝힘으로써 성체 줄기세포에서의 암기원에 대한 기전 연구에 일익을 담당하고자 하였다. 위암상피세포주 AGS, MKN45 각각에 여러 종류의 H. pylori 감염시켰다. H. pylori 균주로는 60190 (cagPAI positive), 8822 (cagPAI negative) 그리고 60190 균주에 cagA, cagE 유전자를 각각 knock-out 시킨 변이된 균주도 사용하였다. H. pylori 감염 후 위암상피세포주에서 Shh, Ptc1 과 Gli1의 전사수준에서의 조절과 단백질의 발현정도를 관찰하기 위해 Real time RT-PCR과 western blotting을 수행하였다. in vivo 연구로는 H. pylori 감염이 확인된 위암환자에서 추출한 위점막조직을 이용하여 면역화학염색 실시하였고, H. pylori 감염여부에 따른 발현의 변화를 분석하였다. Western blotting과 Real time RT-PCR의 결과를 통해 H. pylori 감염이 Shh의 발현을 증가시키는 것을 알 수 있었다. 게다가 cagA positive 균주가 Shh의 발현을 더욱 증가시키는 것이 관찰되었다. Hh 신호전달과정에서 transcriptional target인 Gli1의 단백질과 mRNA가 H. pylori 감염시킨 후 증가하였다. 이는 위암상피세포에서 H. pylori 감염이 Hh 신호전달과정을 활성화 시킨다는 것을 의미한다. in vivo 연구에서 위암환자로부터 얻은 위점막조직의 면역화학염색 결과, H. pylori 감염 된 환자의 조직에서 H. pylori 감염이 되지 않은 환자의 조직보다 Shh와 Gli1의 발현이 높았다. 이번 연구의 결과로 H. pylori 감염과 Shh 발현은 상호연관성이 있는 것으로 밝혀졌다. H. pylori 감염은 위암상피세포주에서 Shh 발현을 증가시킴으로서 Hh 신호전달과정을 활성화 시킨다. 그리고 H. pylori의 중요 단백인 CagA가 위암상피세포주에서 Shh 발현에 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다.

[영문]

Aberrant activation of hedgehog (Hh) signaling pathway leads to pathological consequences in a variety of human tumors. Sonic hedgehog (Shh) is implicated in stem/progenitor cell restitution of damaged gastric mucosa during chronic infection with Helicobacter pylori (H. pylori). H. pylori with various virulence factors cause mucosal damage and may participate in gastric carcinogenesis. The aim of this study was to examine the changes in Shh signal pathways in gastric epithelial cells in response to H. pylori infection. We also assessed the influence of cagA and cagE genes of H. pylori on the Shh expression by gastric epithelial cells. Real time RT-PCR, immunoblot and immunohistochemical stains were performed to analyze the expression, localization and transcriptional regulation of Shh, Patched1 (Ptc1) and Glioma-associated oncogene (Gli1). H. pylori strains 60190 (cagPAI positive), 8822 (cagPAI negative), and gene knock-out mutants H. pylori strains of cagA and cagE were used. AGS and MKN45 cells were used as for gastric epithelial cells. Paraffin-embedded tissues from resected human gastric cancers were used to evaluate the expression of Shh and related signal proteins in vivo. Overexpression of Shh in gastric epithelial cells with H. pylori infection was confirmed by immunoblot and real time RT-PCR. Furthermore, cagA positive strains showed higher level of Shh expression. Gli1 mRNA, the transcriptional target of the Hh pathway, were overexpressed in cells infected with H. pylori compare to uninfected control, implying that H. pylori infection induced the Hh pathway activation in gastric epithelial cells. The Shh positive immunoexpression in H. pylori-infected gastric cancer tissue was higher than those of uninfected gastric cancer tissue while the immunostaining of Shh correlated with tumor differentiation apart from the status of H. pylori infection. In conclusion, Shh expression correlates with the status of H. pylori infection and H. pylori may activate the Shh signal pathways through the up-regulation of Shh in gastric epithelial cells.