Influence of microgroove dimension on cell behavior of human gingival fibroblasts cultured on titanium substrata

Abstract

[한글]

치과용 티타늄 임플란트와 주위 연조직간의 반응을 증진시킬 것으로 기대되는 티타늄 표면 마이크로그루브가 실제 세포행동에 미치는 영향을 규명하려는 노력이 전개되고 있다. 이러한 연구들에서 널리 사용된 마이크로그루브들은 대부분 배양된 세포의 직경보다 작은 1-10μm의 폭을 가지며 섬유아세포의 형태 변화를 야기하여 focal adhesion의 형성을 증가시키고 유전자 발현에 영향을 주는 것으로 알려져 있으나, 실험실 내 세포 증식이나 동물 생체 내 epithelial down-growth에 대한 영향은 아직까지 규명되지 못하였다.본 연구에서는 단일 세포가 안착될 수 있는 충분한 폭과 깊이를 가지는 마이크로그루브가 섬유아세포의 세포행동, 특히 세포생존력 및 증식을 증진시킨다는 가설을 제시하였고, 이의 평가를 위하여 다양한 크기의 표면 마이크로그루브가 부여된 티타늄 기판 상에서 배양된 인간치은섬유아세포의 세포부착, 세포형태, 세포생존력 및 증식, 유전자 발현 등에 대한 분석을 시행하였다. 본 연구의 목적은 티타늄 기판 상에서 배양된 인간치은섬유아세포의 세포행동을 특징 지움에 있어 가장 바람직하게 영향을 줄 수 있는 표면 마이크로그루브의 크기를 규명하고자 하였다.포토리토그래피를 이용하여 순수 티타늄 표면에 폭과 깊이가 각각 15/3.5 μm, 30/3.5 μm, 60/3.5 μm인 마이크로그루브를 부여하고 실험군으로 (TiD15, TiD30, TiD60), 평활한 티타늄 기판을 대조군으로 사용하였다 (smooth Ti). 각 기판 표면에서 인간치은섬유아세포를 24, 48, 72, 96시간 동안 각각 배양하고 크리스탈 바이올렛 염색, XTT분석, 주사전자현미경관찰, reverse transcriptase-polymerase chain reaction 등을 통하여 그루브의 유무와 크기에 따른 세포의 부착, 형태, 생존력 및 증식, 유전자 발현 등의 차이를 분석하였다. 세포부착과 생존력 및 증식의 경우 일요인 분산분석을 이용하여 통계 분석을 시행하였다.이상 4가지 분석의 결과는 다음과 같다.1. 세포부착 분석 결과 티타늄 기판 상에서 배양된 인간치은섬유아세포는 표면 마이크로그루브 유무와 크기에 따른 유의차를 보이지 않았다. 세포 접종 1시간 및 2시간 후 인간치은섬유아세포는 초기 세포-기판 접촉만을 형성하였다.2. 세포형태 분석 결과 표면 마이크로그루브가 부여된 티타늄 기판 상에서 배양된 인간치은섬유아세포는 그루브의 방향과 평행하게 contact guidance를 나타내었다. 30/3.5μm 폭/깊이의 그루브는 배양 후기뿐 아니라 초기에도 그루브 내로 세포를 안착시킬 수 있었다. 능선의 모서리나 그루브의 코너에 위치한 섬유아세포들은 왕성한 filopodia의 형성 등 삼차원 배양 시와 유사한 세포형태를 나타내었다.3. 세포생존력 및 증식의 배양시간에 따른 분석 결과 티타늄 기판 상에서 배양된 인간치은섬유아세포는 표면 마이크로그루브의 크기에 따라 세포 포화 속도에 차이를 보였다. 인간치은섬유아세포는 15/3.5μm 폭/깊이의 마이크로그루브에서 72시간 배양 시 평활한 티타늄 기판에 비하여 유의한 증가를 보였으나 96시간에서 급격한 감소를 나타낸 반면, 30/3.5μm 폭/깊이의 마이크로그루브에서는 96시간까지 지속적이고 점진적인 증가를 나타내었다.4. 15/3.5μm 및 30/3.5μm 폭/깊이의 마이크로그루브에서 배양된 인간치은섬유아세포는 fibronectin과 α-5 integrin 등 기질단백질의 생성과 관계된 유전자 발현의 동반 증가를 나타내었다.5. 30/3.5μm 폭/깊이의 마이크로그루브 상에서 배양된 인간치은섬유아세포는 α-smooth muscle actin 유전자 발현의 감소와 더불어 fibronectin 및 p21 유전자 발현의 증가 등 3차원 세포배양 시 특징적인 유전자 발현의 양상을 나타내었다.이상의 결과에 따라 티타늄 기판 표면 15/3.5μm 폭/깊이의 마이크로그루브는 배양된 인간치은섬유아세포의 세포생존력 및 증식을 증진시키고 기질단백질 생성 유전자들의 발현을 증진시키며, 30/3.5μm 폭/깊이의 마이크로그루브는 인간치은섬유아세포에게 3차원 세포배양의 환경을 제공하여 상응하는 세포형태와 유전자 발현을 유도하는 것으로 결론지을 수 있다

[영문]To enhance interactions between titanium (Ti) oral implants and the surrounding gingival soft tissues, the effects of Ti-surface microgrooves on cell behavior have extensively been investigated. Narrow microgrooves on Ti substrata were verified to induce changes in morphology, cell-substratum adhesion, and gene expression of cultured connective tissue cells, such as fibroblasts. However, their effect on enhancing cell proliferation in vitro or on the ability to effectively reduce epithelial down-growth in vivo, is not yet clear.In this study, we hypothesized that surface microgrooves of appropriate depth and extensive width on Ti substrata that enable the cells to readily descend into themselves, would alter various cell behaviors including viability and proliferation of cultured human gingival fibroblasts. For the evaluation, cell adhesion, morphology, viability and proliferation, and gene expression of human gingival fibroblasts cultured on Ti substrata with various dimensions of surface microgrooves were analyzed. The purpose of this study was to determine the dimension of surface microgrooves on Ti substrata that shows the greatest positive influence on characterizing specific cell behavior of cultured human gingival fibroblasts.Commercially pure Ti discs with surface microgrooves of monotonous 3.5 μm in depth and respective 15, 30, and 60 μm in width were fabricated using photolithography and used as the culture substrata in the three experimental groups in this study (TiD15, TiD30, and TiD60 groups), whereas the smooth Ti disc was used as the control substrata (smooth Ti group). Human gingival fibroblasts were cultured on the four groups of titanium substrata on successive timelines. Cell behaviors, such as adhesion, morphology, viability and proliferation, and gene expression were analyzed and compared between all groups using crystal violet stain, scanning electron microscopy (SEM), XTT assay, and reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR), respectively. One-way analysis of variance was used in the statistical analyses on the adhesion as well as the viability and proliferation data. From the results of the analyses on various biological activities of human gingival fibroblasts, the following results were obtained.1. There was no difference between the numbers of human gingival fibroblasts adhered to smooth Ti substrata and those adhered to Ti substrata with surface microgrooves at 1 and 2 h incubation. Fibroblasts merely formed initial cell-substratum contact by the times.2. In SEM, contact guidance of human gingival fibroblasts parallel to the direction of microgrooves was observed. Cells were able to readily descend into the microgrooves of 30 μm in width and 3.5 μm in depth at the early phase of culture, whereas at the later phase, cells in all groups were found both in the grooves and on the ridges. Cells on the ridge edges or in groove corners were spindle shaped with abundant filopodia formation towards the acid-etched surface inside the microgrooves, thus mimicked the shape of the fibroblasts cultured in three-dimensional (3D) nanoenvironment.3. On successive timelines, human gingival fibroblasts cultured on Ti substrata with various dimensions of surface microgrooves showed differences in the rate of reaching their confluence. Human gingival fibroblasts cultured on Ti substrata with microgrooves of 15 μm in width and 3.5 μm in depth significantly increased their viability and proliferation compared with those cultured on smooth Ti substrata after 72 h of culture and decreased after 96 h, whereas the cells on the microgrooves of 30 μm in width and 3.5 μm in depth continued increasing their viability and proliferation up to after 96 h of culture.4. A joint up-regulation of matrix-assembly genes, such as fibronectin and ?5 integrin genes, was noted in human gingival fibroblasts cultured on titanium substrata with microgrooves of 15 and 30 μm in width and an equal 3.5 μm in depth.5. Gene expression pattern specific to the cells in 3D-matrix culture, such as down-regulation of ?-smooth muscle actin gene along with up-regulation of fibronectin and p21 genes, was pronounced in human gingival fibroblasts cultured on Ti substrata with microgrooves of 30 μm in width and 3.5 μm in depth.In reference to the results above, two conclusions were made.: 1) Surface microgrooves of 15 μm in width and 3.5 μm in depth on titanium substrata increase the viability and proliferation, as well as the expression of genes involved in the matrix assembly of cultured human gingival fibroblasts. 2) Surface microgrooves of 30 μm in width and 3.5 μm in depth on titanium substrata provide human gingival fibroblasts with a three-dimensional context of culture, thus show corresponding gene expression.