Anti-HDM2 peptide를 발현하는 종양 선택적 복제 가능 아데노바이러스의 암세포 살상능 분석

Abstract

[한글]

p53 단백질은 세포의 이상증식을 억제하고, 암세포의 사멸을 유도하는 역할을 하는 종양 억제 유전자로서, 정상 세포 내에서는 낮은 농도로 존재하지만, 산소결핍이나 DNA 손상 등과 같은 스트레스 상황에서는 인산화 되어 핵 내에 축적되고 활성화된다. MDM2 단백질은 p53의 전사 활성 부위에 결합하여 p53의 활성을 저해시키는 단백질로, p53이 활성화되면 MDM2의 발현을 증가시켜, 활성화된 p53을 억제시킬 수 있다. 악성 종양에서 MDM2 단백질이 과발현된 경우가 빈번하여 이는 p53의 활성을 억제하게 되고 그 기능을 제대로 수행 하지 못하게 한다. 이러한 종양 세포의 경우, 야생형의 p53을 도입하더라도 종양 세포 내에 고농도로 존재하는 MDM2에 의해 p53의 분해가 유도되므로 p53에 의한 종양 세포 살상 효과를 크게 기대하기가 어렵다. 또한 항암제 치료 혹은 방사선 치료를 수행할 경우 과발현된 MDM2에 의한 내성으로 인하여 항종양 효과가 급격히 감소한다. 이러한 이유로 인해 최근에는 MDM2 단백질의 과발현을 억제함으로써 p53 단백질의 활성화를 유도하는 새로운 치료 전략이 제시되고 있다.본 연구에서는 MDM2와 결합하여 p53 단백질의 축적을 유도할 수 있는 Tat-anti-HDM2 peptide를 복제 불능 아데노바이러스에 탑재하여 발현시킴으로써 유전자 전달 효율과 Tat-anti- HDM2에 의한 살상능을 관찰하고, 또한 종양 세포 특이적 복제가능 아데노바이러스에 Tat-anti-HDM2를 탑재하여 항종양 효과의 개선 여부를 검증하였다.제작된 Ad-ΔE1-Tat-anti- HDM2 아데노바이러스를 종양세포에 처리하였을 경우 세포 살상이 증가하였고, Western blotting을 통하여 p53 유전자의 발현과 활성화 증가, p21, bax 유전자의 발현 증가, bcl2의 발현 감소를 확인하였다. 또한 FACS 분석을 통하여 Tat-anti-HDM2에 의한 세포 주기 억제와 세포 고사의 증가를 확인할 수 있었다. 종양 선택적 복제 가능 아데노바이러스인 Ad-ΔB7의 E3 부위에 Tat-anti-HDM2를 탑재한 Ad-ΔB7-Tat-anti-HDM2 바이러스에서도 훨씬 더 낮은 역가의 MOI에서 Ad-ΔB7에 비해 증가된 세포 살상 효과가 관찰되었으며, 누드마우스의 U87MG 모델에서 항종양 효과를 검증한 결과, Ad-ΔB7-Tat-anti-HDM2 에서 현저한 종양 성장 억제 효과를 관찰할 수 있었다. 그리고 조직 내 면역염색을 통하여 Tat-anti-HDM2의 발현에 의한 p53 단백질의 핵 내 발현의 증가를 확인할 수 있었다.결과적으로 Tat-anti-HDM2를 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스는 암세포 특이적 복제 및 살상을 유도할 뿐만 아니라 암세포에서만 Tat-anti-HDM2를 발현시킴으로써 종양 내 활성화된 p53을 축적시켜 한 층 더 증대 된 종양 세포 선택적 살상 효과를 유도할 수 있었다.

[영문]The tumor suppressor p53, a potent transcription factor, is a principal mediator of growth arrest, senescence, and apoptosis in response to a broad array of cellular damage. As cells that loss functional p53 are unable to respond appropriately to stress, they can accumulate mutations that favor the development of cancer. p53 is tightly controlled by the MDM2 protein through an auto-regulatory feedback loop. MDM2 transcription is activated by p53 and MDM2 itself, in turn, represses p53 activity. It has been found that the mdm2 gene is amplified or overexpressed in many human malignancies. Therefore, activation of the p53 pathway through inhibition of MDM2 has been proposed as a novel therapeutic strategy. Several recent studies have shown that inhibition of the p53-MDM2 interaction by different macromolecular approaches or by the suppression of MDM2 expression can lead to the activation of p53 and tumor growth inhibition. Here, we reported that the adenovirus expressing Tat-anti-HDM2, or Ad-ΔE1-Tat-anti-HDM2 activate the p53 pathway in cancer cell by inhibition of the p53-MDM2 interaction. We observed that adenovirus expressing Tat-anti-HDM2 induced accumulation of p53 and activation of apoptosis-related genes. As the results, there were increased apoptosis and cell cycle arrest following expression of Tat-anti-HDM2. To enhance the therapeutic efficacy, we developed the E1A-modified oncolytic adenovirus expressing Tat-anti-HDM2, Ad-ΔB7-Tat-anti-HDM2. It was shown that so this oncolytic adenovirus enhanced the killing effect than Ad-ΔE1-Tat-anti-HDM2 to the tumor cells by increased apoptotic activity. As shown our data, Ad-ΔB7-Tat-anti-HDM2 has increased killing effect to cancer cells but not to normal cells. Therefore, we expect that Ad-ΔB7-Tat-anti-HDM2 might be effective cancer therapeutic oncolytic adenovirus to exert its enhanced cytotoxic effect to cancer.