HLA-A2 supertype에 제한적인 CD8+ T세포의 보호면역반응을 효율적으로 유도하는 결핵균 펩티드 항원결정기의 동정

Abstract

[한글]결핵은 결핵균 (Mycobacterium tuberculosis)에 의하여 유발되고, 호흡기를 통해 전염되는 질병이다. 결핵 발병률은 효율성이 높은 항 결핵치료제의 개발로 계속 감소 추세에 있었으나, 최근 사람 면역결핍 바이러스와의 동시감염과 다제내성 결핵의 증가 등의 원인으로 인해 그 발병률이 전 세계적으로 다시 증가하고 있다. BCG는 현재 유일하게 사용되고 있는 결핵 예방백신이다. 그러나 그 효율성이 0-80%로 매우 다양하므로 더 효과적인 결핵 백신 개발이 절실히 요구되고 있다.여러 연구들에 의해 BCG는 주로 CD4+ T세포의 면역반응을 유도함이 확인 되었다. 한편, 많은 논문들을 통해, 결핵균 감염에 대한 보호면역에서 CD8+ T세포 면역반응의 중요성이 강조되었다. 그러므로, 결핵균에 특정한 MHC class Ⅰ restricted CD8+ T세포의 면역반응을 효율적으로 유도할 수 있는 항원결정기의 동정은 BCG를 보강할 수 있는 백신 개발과 결핵에 대한 CD8+ T세포의 보호면역 반응 연구에 많은 도움을 주리라고 기대된다. 이를 위해, 본 연구에서는 이전 연구에서 선별된 soluble HLA-A*0201와 결합 친화력이 높은 결핵균 펩티드 64개의 세포면역반응의 유도기능을 분석하여, CD8+ T세포의 주 기능인 IFN-γ 분비와 세포독성능을 유도하는 HLA-A*0201에 제한적인 항원 결정기를 찾고자 하였다. 그리고, 본 연구에서 동정된 결핵균의 항원결정기 펩티드들이 대식세포내의 결핵균의 genome에서 실제로 전사되고 표현되는지 증명하고자 하였다.본 연구 결과, 64개의 펩티드 중 CD8+ T세포의 IFN-γ 분비를 효율적으로 유도하는 6개의 펩티드를 선별하였고, 그 중 4개의 펩티드들이, HLA-A*0201을 표현하는 개체뿐만 아니라 HLA-A*0206, HLA-A*0207을 표현하는 PPD+인 건강한 개체들과 결핵환자의 말초혈액에서 세포독성능을 유도함을 확인하였다. 이로써, 이 펩티드들은 HLA-A2 supertype인 개체에서 면역반응을 유도하는 항원결정기라고 할 수 있다. 그리고, in vitro immunization 방법에 의해 생성된, 4개의 후보 펩티드들에 특정한 CD8+ T cell line은 각 펩티드를 제시하고 있는 표적세포에 대해 세포독성능을 나타내었고, 그 중에서도 19번과 28번 펩티드에 특정한 CD8+ T cell line은 각 펩티드를 제시하는 표적세포뿐만 아니라 결핵균에 감염된 대식세포에 대해서도 세포독성능을 나타내었다.이러한 연구결과로써, HLA-A2 supertype인 개체들에서 결핵균에 대한 CD8+ T세포의 보호면역반응을 유도할 수 있는 결핵균의 새로운 항원결정기 2개가 본 연구에서 동정되었으며, 이들은 HLA-A2 supertype을 표현하는 개체들을 대상으로 하는 subunit 백신 개발에 기여할 수 있다고 기대된다.

[영문]Tuberculosis (TB), a chronic infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis (MTB), is one of the major public health problems in the world. The importance of cytotoxic T lymphocytes (CTLs) in protective immunity against MTB is supported by their presence in mycobacterium-infected animals and by their ability to prevent bacillary dissemination in these animals. CD8+ T cell-deficient mice showed enhanced susceptibility to TB. In humans infected with MTB, CD8+ T cells recognize mycobacterial antigens, lyse MTB-infected monocyte-derived macrophages and alveolar macrophages, and directly kill MTB by secreting the antimicrobial peptide, granulysin. CD8+ T cell epitopes are recognized in the context of major histocompatibility complex (MHC) class I molecules, and human leukocyte antigen (HLA)-A2 supertype is a class I allele that is expressed at high frequency in individuals of a variety of ethnic backgrounds. The HLA-A2 supertype is a family of HLA subtypes that share specificities for a degenerate ligand with HLA-A*0201. The A2 supertype includes the A*0201, A*0202, A*0203, A*0204, A*0205, A*0206 and A*0207, A*6802 and A*6901 types, and A2 supertype epitope peptide can bind to the HLA molecules of supertype members. Therefore, identification of MTB peptides that are recognized by HLA-A2 supertype is important for vaccine development.In order to identify MTB derived epitopes eliciting efficient MHC class Ⅰrestricted CD8+ T cell immune responses, in our previous approach, we screened a phage display library exposing MTB peptides encoded from whole genome by using soluble HLA-A*0201 molecules as tools. The selection of MTB peptides on the surface of phages with soluble HLA-A*0201 molecules suggest that these selected peptides have high binding affinities to HLA-A*0201 molecules. As a result, we identified 64 9-10-mer peptide epitopes which contain binding motifs for HLA-A*0201 molecules. These peptides were screened to test the immuno-dominance. As a result, we identified four candidate epitope peptides specific for HLA-A2+-restricted CD8+ T cells. These epitope peptides are derived from uncharacterized hypothetical proteins from MTB. We observed the CD8+ T cell lines specific for these epitope peptides showed the cytotoxic activity and produced IFN-gamma in response to these epitope peptides pulsed target cells. And the CD8+ T cell lines specific for two epitope peptides showed the cytotoxic activity against MTB infected macrophages generated from HLA-A*0201 subjects. In addition, the expression of hypothetical proteins encoding these epitope peptides was verified using TB patients and RT-PCR analysis. These peptides are likely to represent promising components for future subunit vaccine against human TB.