다양한 세포주에서 in-gel hybridization에 의한 telomeric 3'-overhang길이 분석

Abstract

[한글]세포는 어느 시기가 되면 분열이 멈추는 노화(senescence) 단계에 다다르게 된다. 매 세포 분열마다 telomere에서 50∼200 nucleotide가 제거됨으로써 지속적인 telomere 감소가 일어나고 결국 세포 주기의 지연과 세포노화를 유발하여 세포는 죽게 된다.Telomere는 이중 가닥이지만, telomere의 끝은 약 150 bases의 3’-overhang 단일 가닥 구조를 갖고 있다. 이 단일 가닥의3’-overhang은 T-loop 구조를 형성함으로써 exonuclease에 의한 degradation과 end-to-end fusion으로부터 염색체를 보호하는 기능을 한다. 이처럼3’-overhang이 chromosomal stability에 있어서 중요한 역할을 할 것이라고 예상되나, 현재까지 mammalian cells에서의 3’-overhang 조절 기전에 대해서 명확하게 알려지지 않았다.In-gel hybridization 방법은 hybridization signal의 intensity를 통해 단일 가닥의target DNA의 양을 측정하는 간단한 방법으로 하나의 gel 상에서 3’-overhang과 telomere 길이를 모두 측정할 수 있다는 장점을 지닌다. 따라서 본 연구에서는 in-gel hybridization 방법을 이용하여 3’-overhang 길이를 측정하는 기법을 확립하고, 6정상 세포주와 58종양 세포주의 gDNA를 가지고 in-gel hybridization 방법을 수행함으로써 세포주간에 3’-overhang 과 telomere길이를 비교 분석하였다.1. 3’-overhang 길이를 암 종에 따라 비교해본 결과 다양한 길이를 나타내었고, 또한 하나의 암 종안에서도 다양한 길이의 3’-overhang이 관찰되었다. 이 중 대장암, 뇌암 그리고 자궁경부암의 경우 control HeLa intensity (HI)에 비해 평균 55±17.2 %의 비교적 낮은intensity를 보였으며 위암, 유방암, 폐암, 간암 그리고 혈액암의 경우에는 평균 83±57.0 %의 intensity를 보였다. 그러나 암 종간의 3’-overhang길이 차이를 통계적으로 분석하였을 때 유의성을 볼 수는 없었다.2. 정상 세포주와 종양 세포주간의 3’-overhang 길이를 비교한 결과 종양 세포주 (평균 77±52.1 %)에 비해 정상 세포주 (평균 147±50.4 %)에서 비교적 높은 3’-overhang intensity를 나타내었으며, 이는 통계적으로도 유의한 차이를 보였다 (p = 0.002). 이에 반해, telomere 길이에서는 정상 세포주 (평균 6.1±1.6 Kb)와 종양 세포주(평균 5.5±3.3 Kb)간에 유의한 차이를 나타내지 않았다.3. 우리나라에서 가장 호발하는 암인 위암 세포주에서 3’-overhang 과 telomere 길이 사이의 상관 관계를 알아보았다. 23 위암 세포주를 대상으로 3’-overhang과 telomere 길이 사이의 상관 분석을 시행한 결과 positive 상관관계를 나타내었다 (r= 0.67, p=0.001).이상의 결과는 차후의 3’-overhang길이의 조절기전이나, 3’-overhang과 telomere 길이에 상관성을 갖게 하는 작용기전 또는 chromosomal stability에 3’-overhang이 미치는 영향 등을 연구함에 있어 많은 도움을 줄 것으로 사료된다.

[영문]Linear chromosomes are capped by telomeres. In most organisms, telomeric DNA consists of simple repeats with a G-rich strand running towards the 3′end. This strand is longer than the complementary C-rich strand, forming a single-stranded overhang at the distal end of telomeres. In human cells, this 3’-overhang is between 10 and 100 of telomeric repeats, TTAGGG, in length. 3′-overhangs are likely to participate in a number of important functions. Obviously, they are templates for telomere elongation by telomerase and essential for the formation of T- loops. It is very probable that this structure protects not only the overhang, but the very end of the chromosome itself from degradation and recognition as a target for nonhomologous end joining. However, the mechanism of long-tail formation, the presence and the role of these structures in telomere maintenance or shortening are not completely understood. Here, we examined the 3’-overhang size in human cells including 6 normal cell lines and 58 cancer cell lines from 8 breast, 4 cervix, 5 colorectal, 23 gastric, 6 hepatoma, 4 brain, 5 lung, 3 hematologic by using in-gel hybridization. The 3’-overhang size was determined as a ratio relative to the HeLa’s overhang intensity (HI) in each sample. Low intensity was noted in cervix, colorectal and brain cancer cells with mean value of 55±17.2 % of HI. Gastric, breast, hepatoma, lung and hematologic cancer cells showed the intensities in wide range from 23 to 308 with mean value of 83±57.0 % of HI. Interestingly, normal cells, originated from fetus, revealed strong 3’-overhang intensity with mean value of 155±52.6 % of HI. In contrast to the 3’-overhang, telomere length showed no apparent difference in cancers and normal cells. Also, we observed that 3’-overhang correlated with the telomere length in gastric cancer cell lines. This study revealed that cells from fetus have long 3’-overhang while cancer cells with variable 3’-overhang sizes, suggesting that 3’-overhang length is likely regulated in early development. This result might play a significant role in 3’-overhang mechanism study.