CAG promoter를 이용한 GDNF 및 VEGF 발현 재조합 adenovirus의 제작과 인간 신경줄기세포 감염 후 근위축성 측삭 경화증 동물모델에 이식

Abstract

[한글]근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis; ALS)은 진행성 운동신경질환으로 뇌와 척수의 운동신경세포가 선택적으로 소실되며, 운동신경세포의 지배를 받는 근육이 점차 위축되어 사망한다1,2. 100,000명 당 2-3명의 유병율을 보이며, 발병 3-5년 이내에 사망한다1,2. ALS 환자 중 90-95%는 유전적 요인을 찾을 수 없는 산발성(sporadic) ALS이고, 5-10%는 상염색체 우성/열성으로 유전되는 가족성(familial) ALS이다1. 가족성 ALS의 약 20%에서 세포내 활성산소 제거효소인 Copper/Zinc superoxide dismutase(SOD1) 유전자의 돌연변이가 발견된다2. 현재까지 125개의 각기 다른 SOD1 유전자 돌연변이가 동정되었는데, 이 중 114개의 돌연변이가 ALS의 원인이 되는 것으로 밝혀졌다1.본 연구에서는 ALS의 동물모델로서 인간 SOD1 유전자의 93번째 아미노산인 Glycine이 Alanine으로 치환된 돌연변이를 가지고 있는 형질전환 쥐 (transgenic mice)를 사용하였다.인간 신경줄기세포는 임신 13주에 자연 유산된 태아의 종뇌(telencephalon) 에서 분리, 배양하여 확립하였고, 줄기세포에 CAG(CMV-actin-globin hybrid) 프로모터 (promoter)를 이용하여 제작한 GDNF 및 VEGF 발현 재조합 아데노바이러스로 각각 감염시켜, 생후 75일된 SOD1G93A 형질전환 쥐의 cisterna magna부위에 이식하였다.재조합 아데노바이러스 감염 후 GDNF 혹은 VEGF 발현 인간 신경줄기세포는 모델동물에 이식된 후, 숙주 중추신경계에 광범위하게 이주 및 생착함이 관찰되었고, 공여세포는 주로 신경교세포로 분화하였으며, 소수에서는 미성숙한 신경원세포로 분화하였고, 일부 세포는 미분화된 상태로 존재하였다.GDNF 및 VEGF을 과 발현케 한 인간 신경줄기세포를 이식한 실험군과 H-H buffer만 이식한 대조군을 비교한 결과, 실험군은 대조군에 비해 유의하게 체중감소가 억제되었고, 상지근력의 감소가 향상되었으며, 운동조정능력의 감소가 개선되었고, 그리고 생존일수가 증가함을 보였다.

[영문]Amyotrophic lateral sclerosis is a fatal neuromuscular disease characterized by loss of motor neurons in brain and spinal cord, resulting death. The incidence of ALS are 2-3 per 100,000 each year and most paients are death within 3-5years after disease onset. Approximately 90-95% cases are classed as sporadic ALS, 5-10% cases are inherited ALS(known as familial ALS;FALS). 114 distinct mutations in the ubiquitously expressed enzyme Copper/Zinc superoxide dismutase(SOD1) have been identified in approroximately 20% of inherited ALS and 11 silent mutations are identified.We used transgenic mice(B6SJL-TgN(SOD1-G93A)1Gur) from Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) engineered to overexpress a mutated form of human SOD1 carring Gly93→Ala mutations.Human neural stem cells isolated from telencephalone of human fetal cadavers at 13 weeks of gestation, infected GDNF or VEGF expressing recombinant adenovirus using CAG(CMV-actin-globin hybrid) promoter and transplatation into SOD1G93A transgenic mice cisterna magna region at age of 75days old.GDNF or VEGF expressing hNSC(human neural stem cells) showed robust engraftment throughout the whole CNS(central nervous system). Most of donor-derived cells were differentiate into glial cells, however some of engraft cells still remained immature cells.GDNF expressing hNSC transplantation group and VEGF expressing hNSC transplantation group showed longer survival rate than H-H buffer injection group and enhance forelimb strength and motor coordination.