위암 세포의 이동에 대한 thymidine phosphorylase의 역할

Abstract

[한글]세포의 이동능의 획득은 암의 전이에 있어 중요한 과정으로 세포 가 세포외기질에 부착되는 것으로 시작되며, 이로 인해 세포내의 다 양한 신호전달기작이 활성화된다. 이 중 focal adhesion kinase (FAK)는 focal adhesion의 형성으로 활성화되며 내부 tyrosine잔 기들의 인산화에 의해 활성화되어 다른 세포질, 세포골격 단백질이 세포의 부착부위에 결합되는 것을 유도한다. 또한 성장인자와 integrin 에 의해 활성화 되는 phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)는 Akt및 그 하부 단백질들의 인산화를 유도함으로서 여러 세포기능을 조절하며, 세포의 생존, 증식, 이동 등에 영향을 미친다.Thymidine phosphorylase (TP)는 사람의 platelet-derived endo- thelial cell growth factor (PD-ECGF)와 동일 물질로서 thymidine 을 thymine과 2-deoxy-D-ribose (2dR)로 전환시킬 뿐 아니라 신 생혈관 유도물질로서 작용한다. TP는 많은 암종에서 주위 정상조직 에 비해 높게 발현되며, 신생혈관유도 능력과 상관없이 TP의 발현 은 임상적으로 불량한 예후의 지표로 알려져 있다. 이것은 TP가 신생혈관유도 능력뿐만 아니라, 그 자체가 암의 진행에 생물학적 연 관이 있을 것 이라는 가능성을 제시한다. 따라서 본 연구에서는 TP 와 이의 효소 작용의 매개체인 2dR이 위암세포의 이동능에 미치는 영향을 관찰하고, 이와 관련된 신호전달경로를 알아보고자 하였다.본 실험을 위해 MKN-45 세포주에 TP를 과발현시킨 세포주 (MKN-45/TP)를 확립하였으며, 세포내 TP의 발현을 보이는 AGS 세포주를 연구에 함께 사용하였다. 세포의 이동능과 부착능을 각각 matrigel을 coating한 상태에서 migration assay 와 adhesion assay로 평가하였다. TP와 2dR의 억제제인 TPI (TP inhibitor)와 2LR (2-deoxy-L-ribose)을 처리하여 TP와 2dR이 세포의 이동능 에 영향을 미친 다는 것을 확인하였으며, 면역형광염색법을 이용하 여 세포내 actin의 분포를 확인 하였다. 세포의 이동에 관련된 신호 전달기작을 확인하기 위해 FAK, Akt, P70S6K 에 대한 immuno-blotting을 수행하였으며 모든 결과는 평균 ± 표준편차로 나타냈다.1. 세포이동능 조사에서 MKN-45/TP세포주는, 모세포주와 mock transfection 세 포주 (MKN-45/CV)에 비해 이동능이 증가하였으 며, 외부에서 TP나 2dR을 첨가 하였을 경우 배양액만을 넣었을 때 보다 세포의 이동이 증가하였다. TP억제제를 처리하였을 때 TP 가 과발현되는 세포주의 이동이 감소하였으며, 2dR의 억제제인 2LR을 처리하였을 때는 이동능이 약간 감소되었다. 세포내 TP를 발현하는 AGS 세포주는 세포외에서 주입된 TP와 2dR에 의해 이 동능이 증가하였다. TPI와 2LR에 의한 이동능의 감소는 미약하게 나타났는데, 이는 세포주내의 TP발현정도와 연관이 있을것이라 여 겨진다.2. 세포의 부착능을 조사하였을 때 MKN-45세포주와 AGS세포주 모두 TP와 2dR의 첨가에 의해 세포의 부착능이 증가하였다. AGS 세포주에 대해 형광면역염색을 수행하여 세포내 actin의 분포를 확 인하였을 때 세포내에 actin의 발현이 증가 하였으며 세포부착면적 의 변화에 의해 세포의 부착능이 증가함을 확인하였다.3. 이와 같은 결과를 바탕으로 TP와 2dR에 의해 세포의 이동능 이 증가할때 세포이동에 관여하는 신호전달경로의 변화를 확인하였 다. FAK의 인산화를 확인하였을 때, 대조군을 포함한 모든 실험군 에서 Tyr397/576 잔기의 인산화가 진행되었으며 시간에 따른 변화 역시 나타나지 않았다. 다른 신호전달 경로인 PI3K/Akt pathway 의 경우, TP와 2dR 첨가 후 6시간 부터 Akt의 인산화가 증가하였 으며, Akt의 하위작동단백질인 p70S6K 역시 인산화가 증가함을 관찰하였다. 이러한 결과는 TP와 2dR이 암세포의 이동에 있어 PI3K/Akt 경로에 관여하리라는 것을 제시한다.본 연구를 통해 세포내 TP의 발현과 외부에서 주입된 TP와 2dR 이 세포의 이동능과 세포의 부착능을 증가시킴을 확인하였다. TP 와 2dR에 관련된 위암 세포의 이동능 향상에 PI3K/Akt 경로가 연 관되어 있음을 확인하였으며 이러한 in vitro 실험결과는 TP의 발 현이 일부암에서 불량한 예측인자로 적용될 수 있는 기전을 설명해 줄 수 있다고 사료된다.

[영문]The first step of metastatic process is the movement of cancer cells and the cell migration is initiated by cell adhesion to its extracellular matrix (ECM). Focal adhesion is a site where cell attachment and focal adhesion kinase (FAK) is recruited by integrin engagement with ECM. FAK is activated by its own tyrosine-phosphorylation and is accompanied by the recruitment of other cytoplasmic and cytoskeletal proteins to the focal adhesion.Thymidine phosphorylase (TP) is identical to human platelet-derived endothelial cell growth factor (PD-ECGF), and it is involved both in pyrimidine nucleoside metabolism that catalyzes the reversible conversion of thymidine to thymine and 2-deoxy-D-ribose (2dR), and in angiogenesis. Expression of TP is higher in cancer compared to adjacent non-tumor tissue, and is correlated with angiogenic activity in various tumor types. However, TP has been reported to an independent indicator of unfavorable clinical outcome in renal and colorectal cancer irrespective of its angiogenic activity, suggesting that TP might be involved in cancer progression independent of its angiogenic activity. Hence, I herein investigated the effects of TP and its catalyte, 2dR on the migration of cancer cell in gastric cancer.The levels of TP expression in various gastric cancer cell lineswere shown to be associated moderately with the movement through matrigel in gastric cancer cell lines (R2=0.473). Then, we established a TP-expressing stable cell line, MKN-45/TP. It showed enhanced migration ability through matrigel compared to parental cells and mock transfectant (MKN-45/CV) in migration assay. Also, the addition of TP or 2dR induced higher chemotaxis compared to media alone in MKN-45/TP and AGS. These suggested that the cancer cells with high expression of TP induced cancer cell migration. Treatment of specific TP inhibitor (TPI) showed suppression of TP-mediated cancer cell migration, confirming the effect of TP on cell migration. In adhesion assay, exogenous TP and 2dR stimulated cell adhesion on matrigel, and TP-transfected cells also enhanced adhesion.Next, signaling pathways that related to cell migration were investigated. First, the level of phosphorylated FAK showed little difference between MKN-45/TP and MKN-45/CV, because the baseline phosphorylation level of FAK level was already high in its own residues. Meanwhile, the phosphorylated level of phos- phatidylinositol 3-kinase (PI3K), Akt and its down-stream effector p70S6K were increased after exposure to TP or 2dR. TP-related cell migratory effect was partially abrogated by the treatment of the PI3K inhibitors. These findings indicate that TP and 2dR is promoting cancer cell adhesion and migration in gastric cancer, at least in part, by regulation of the PI3K/Akt pathway.